隱性脊柱裂脊髓中神經(jīng)元型一氧化氮合酶、脂肪及尼氏體含量的組織學(xué)分析.pdf

1、目的：隱性脊柱裂(spina bifida occulta，SBO)，是由于脊柱骨質(zhì)的先天缺陷，導(dǎo)致局部椎弓有異常裂隙，但表面有皮膚覆蓋，無(wú)脊膜或神經(jīng)組織膨出，多發(fā)生在L5-S1平面。隱性脊柱裂患者常見(jiàn)多種類型的臨床癥狀，主要包括局部皮膚異常、尿失禁、尿路感染、便秘、下肢深反射亢進(jìn)、后背痛、內(nèi)翻足、進(jìn)展性脊柱側(cè)彎、雙腿生長(zhǎng)不對(duì)稱等。以上癥狀多數(shù)由于合并脊髓栓系而引起，脊髓和神經(jīng)根由于被壓迫或牽引而未能正常上移，造成低位脊髓，馬尾圓錐和終

2、絲神經(jīng)缺血缺氧，導(dǎo)致潛伏性和進(jìn)展性的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷。隱性脊柱裂常因合并椎管內(nèi)其他畸形而導(dǎo)致脊髓栓系，如椎管內(nèi)脂肪瘤、脊髓縱裂、脊髓空洞癥、脊髓積水等．尚有部分病例未并發(fā)脊髓栓系而出現(xiàn)癥狀，其發(fā)病機(jī)制不清。另外隱性脊柱裂可能伴發(fā)其他畸形，如先天性脊柱側(cè)彎或明顯的肢體短縮、末端脊髓積水、脊髓縱裂等，軸外系統(tǒng)畸形最常見(jiàn)的是肛門直腸畸形及泌尿生殖系統(tǒng)畸形(腎臟畸形)。隱性脊柱裂發(fā)生率較高，約為正常人群的20％左右．但目前我們對(duì)其認(rèn)識(shí)較少，僅有藥物

3、或基因敲除動(dòng)物模型的制作、組織HE染色、凋亡、神經(jīng)示蹤等研究，對(duì)其發(fā)病機(jī)制及病理改變認(rèn)識(shí)有限，而且沒(méi)有良好的預(yù)防和治療措施。因此，針對(duì)隱性脊柱裂畸形的胚胎發(fā)生規(guī)律和病理改變還有很大的研究空間，其研究成果有利于我們對(duì)這一發(fā)病率較高的疾病的深入認(rèn)識(shí)，更可以進(jìn)一步指導(dǎo)畸形的產(chǎn)前預(yù)防和早期有效治療，對(duì)減少出生缺陷、提高人口素質(zhì)具有極其重要意義。 無(wú)機(jī)氣體分子一氧化氮(NO)是非腎上腺素能、非膽堿能(nonadrenergic nonch

4、olinergic，NANC)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，是一種重要的神經(jīng)信息物質(zhì)，大量的研究表明：NO具有重要的信息傳遞作用。一氧化氮合酶(NOS)分三種類型，其中神經(jīng)元型一氧化氮合酶(NOS1)廣泛存在于中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)及心血管、消化、泌尿生殖系統(tǒng)等的神經(jīng)通路中，通過(guò)催化產(chǎn)生NO而與這些系統(tǒng)的功能均密切相關(guān)。NOS工近些年來(lái)倍受學(xué)術(shù)界的矚目，在腦損傷、尿失禁、缺血再灌注、應(yīng)激等情況下的研究較多。這些研究表明，胃腸組織可在NOS1催化下產(chǎn)生N

5、O，參與對(duì)腸道平滑肌收縮的NANC神經(jīng)調(diào)節(jié)。泌尿系統(tǒng)中，尿道外括約肌復(fù)合體和尿道周圍盆底橫紋肌協(xié)同作用負(fù)責(zé)產(chǎn)生尿道壓力，防止尿失禁的發(fā)生。且研究發(fā)現(xiàn)人類尿道壁內(nèi)橫紋括約肌中含有NOS染色陽(yáng)性的神經(jīng)纖維和肌纖維。因此，在隱性脊柱裂中研究脊髓中NOS1水平，有利于了解其脊髓病理特點(diǎn)，有助于對(duì)臨床癥狀做以解釋。臨床上可見(jiàn)隱性脊柱裂合并椎管內(nèi)脂肪瘤，并常因此導(dǎo)致脊髓栓系的產(chǎn)生。脊髓和神經(jīng)根由于被脂肪瘤壓迫不能維持其正常位置，更重要的是造成馬尾圓

6、錐和終絲神經(jīng)缺血缺氧，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物模型研究隱性脊柱裂椎管內(nèi)是否有脂肪瘤多發(fā)，并研究其對(duì)周圍脊髓和神經(jīng)纖維的影響。尼氏體被稱為核蛋白體，是合成蛋白質(zhì)的主要場(chǎng)所。在病理情況下，尼氏體對(duì)缺血、缺氧、中毒等極為敏感，故尼氏體可以作為觀察神經(jīng)細(xì)胞損害的靈敏指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)以脊髓內(nèi)神經(jīng)元中尼氏體含量為觀察指標(biāo)，觀察隱性脊柱裂脊髓神經(jīng)元功能是否受到影響。 本實(shí)驗(yàn)利用丙戊酸致畸制作隱性脊柱裂畸形的胎鼠動(dòng)物模型，并以脊髓內(nèi)N

7、OS1含量、脂肪含量和神經(jīng)元內(nèi)尼氏體含量為觀察指標(biāo)，研究隱性脊柱裂胎鼠脊髓的病理改變特點(diǎn)，并進(jìn)一步探討其發(fā)病機(jī)制。 方法： 在Wistar大鼠孕9天于9：00和16：00，分別給予實(shí)驗(yàn)組孕鼠20％丙戊酸鈉(VPA)350mg/kg(總量700mg/kg*d)后肢皮下注射，對(duì)照組孕鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予0.5ml生理鹽水后肢皮下注射。大鼠于孕21天剖宮取出胎鼠，記錄總胚胎數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)及吸收胎數(shù)，檢查外觀判定是否有外觀可見(jiàn)

8、畸形并記錄。取胎鼠脊柱標(biāo)本阿爾新藍(lán)軟骨染色后實(shí)體顯微鏡下數(shù)碼相機(jī)采集脊柱軟骨染色圖像，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件測(cè)量出腰4到骶3每個(gè)椎體椎弓兩個(gè)軟骨端距離并判定是否存在隱性脊柱裂。采集圖像后部分標(biāo)本制作腰骶段脊柱橫斷面冰凍切片，通過(guò)免疫熒光染色方法測(cè)定脊髓中NOS1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，通過(guò)油紅O染色觀察脊髓中脂肪含量。其余標(biāo)本制作腰骶段脊柱橫斷面石蠟切片，通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色觀察脊髓神經(jīng)元中尼氏體含量及神經(jīng)元形態(tài)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包，采用

9、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(取雙側(cè)檢驗(yàn))，p<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果： 對(duì)照組60只胎鼠椎弓軟骨端距離均在正常參考值范圍，無(wú)隱性脊柱裂畸形出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組92只胎鼠中腰骶段椎弓軟骨間距離大于正常參考值范圍的有87只，判定為隱性脊柱裂(發(fā)生率為95％)。正常組NOS1陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目較少，胞漿著色程度較深，細(xì)胞的形狀大小及分布均勻；畸形組中NOS1陽(yáng)性神經(jīng)元明顯多于正常組(p<0.01)，部分細(xì)胞胞漿輕度著色，細(xì)

10、胞形態(tài)及分布不規(guī)則。脂肪染色結(jié)果正常組及畸形組胎鼠脊髓內(nèi)均未見(jiàn)被油紅O染成紅色的中性脂肪組織，周圍脊膜處可見(jiàn)散在少量染色陽(yáng)性的脂肪組織，兩組間無(wú)顯著差異。尼氏體染色正常組神經(jīng)元數(shù)目較多、色深；畸形組神經(jīng)元數(shù)目明顯減少(P<0.01)，染色變淺，胞漿內(nèi)尼氏體減少或缺失，光密度值下降(P<0.01)，可見(jiàn)腫脹變圓的神經(jīng)元。 結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隱性脊柱裂胎鼠腰骶段脊髓中NOS1分泌增多，尼氏體含量減少，提示這可能是隱性脊柱