頸動(dòng)脈神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦出血后遺癥的時(shí)間窗及療效的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞的移植方法及移植時(shí)間仍存在爭(zhēng)議。腦實(shí)質(zhì)內(nèi)單個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)直接注射的移植方法，易造成局部腦損傷；移植的細(xì)胞集中在注射局部腦組織內(nèi)，不利于細(xì)胞在腦組織內(nèi)的分布；另外，細(xì)胞暴露于病灶的炎性環(huán)境中，存活率明顯降低。腦室內(nèi)移植可使細(xì)胞較為廣泛分布于腦內(nèi)，但創(chuàng)傷較大而且必須克服血腦屏障及腦脊液．腦屏障的限制。經(jīng)尾靜脈神經(jīng)干細(xì)胞移植，簡(jiǎn)單易于操作、侵襲性小，移植的細(xì)胞能夠特異性的遷移到病理位置。首過(guò)效應(yīng)，細(xì)胞被中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的組織所

2、攝取，以及隨血液循環(huán)時(shí)長(zhǎng)時(shí)間暴露于網(wǎng)狀內(nèi)皮及免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致其移植效率降低。另外，經(jīng)皮頸動(dòng)脈注射能夠高效的將藥物導(dǎo)入局部病灶，易于操作、并且創(chuàng)傷小。因此在本實(shí)驗(yàn)中，我們將體外擴(kuò)增的BrdU標(biāo)記的鼠胎腦神經(jīng)干細(xì)胞，通過(guò)頸動(dòng)脈注射入膠原酶(Ⅶ型)/肝素誘導(dǎo)建立的腦出血?jiǎng)游锬Ｐ停芯款i動(dòng)脈神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)腦出血的治療作用和細(xì)胞移植效率，從而尋找一個(gè)高效的、侵襲性較小的神經(jīng)干細(xì)胞的移植方法。 實(shí)驗(yàn)方法： 1．取孕14天的Wistar

3、胎鼠，解剖顯微鏡下取出胚胎大鼠大腦皮層。0.25﹪胰蛋白酶/0.02﹪EDTA(1:1)消化后，吸管輕輕吹打，使大部分組織塊分散成單個(gè)細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)狀態(tài)。離心后，棄上清，洗滌沉淀細(xì)胞2次。加入神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×10<'5>cells/ml濃度進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)。 分別采用機(jī)械分離與胰酶消化神經(jīng)球的分離方法進(jìn)行NSCs傳代培養(yǎng)，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定分離后細(xì)胞存活率，觀察不同傳代方法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的損傷

4、作用。 繪制神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間，研究不同傳代方法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的影響。 采用機(jī)械分離或胰酶消化的方法連續(xù)傳代、長(zhǎng)期穩(wěn)定培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞增殖率，比較研究長(zhǎng)期培養(yǎng)條件下，不同傳代方法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖率的影響。 取第4代、8代、12代、20代以及30代，穩(wěn)定的機(jī)械分離傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球接種到24孔培養(yǎng)板中的蓋玻片上，加入神經(jīng)干細(xì)胞分化培養(yǎng)液進(jìn)行分化培養(yǎng)，研究長(zhǎng)期培養(yǎng)條件下神經(jīng)干細(xì)胞的

5、神經(jīng)發(fā)生能力的變化。 2.50只Wistar大鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和生理鹽水對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組25只大鼠，應(yīng)用立體定向紋狀體內(nèi)注射膠原酶(Ⅶ型)/肝素方法建立ICH模型。10﹪水合氯醛腹腔注射麻醉，應(yīng)用微量注射泵將0.7μl生理鹽水/0.14UⅣ型膠原酶/1.4U肝素緩緩注射入尾狀核內(nèi)(冠狀縫后0.2mm，外側(cè)3.0mm，腹側(cè)6.0mm)。生理鹽水對(duì)照組25只大鼠，僅接受腦內(nèi)注入等量生理鹽水。 手術(shù)后2小時(shí)及每天對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組

6、大鼠進(jìn)行行為功能測(cè)試，檢測(cè)其神經(jīng)功能缺損情況。 術(shù)后1天，3天，5天，7天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別處死5只大鼠，斷頭取腦，距離針道前后2mm．冠狀切取腦組織，觀察血腫形態(tài)、水腫情況，計(jì)算腦組織含水量。 試驗(yàn)結(jié)束后，處死各組最后5只大鼠；常規(guī)HE染色，觀察出血腦組織顯微病理改變。 3．取穩(wěn)定培養(yǎng)傳至4-6代的神經(jīng)干細(xì)胞，移植前三天于培養(yǎng)基中添加BrdU(5gmol/l)標(biāo)記細(xì)胞，用于追蹤遷移、存活于宿主體內(nèi)的移植細(xì)胞。

7、移植前收集神經(jīng)干細(xì)胞球，胰酶消化分離為單細(xì)胞，重懸為1×10<'4>cells/μl的細(xì)胞懸液以備移植。取膠原酶(Ⅶ型)/N：素誘導(dǎo)建立的48只Wistar大鼠ICH模型，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組大鼠分別在ICH后2、7、14、21、28天進(jìn)行頸動(dòng)脈NSCs移植(400μl DMEM，含4×10<'6>NSCs)。對(duì)照組8只大鼠，僅接受頸動(dòng)脈內(nèi)注入等量DMEM培養(yǎng)液。 腦出血后1天和移植后每周對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠進(jìn)行行為功

8、能評(píng)價(jià)。 于腦出血后2月處死所有動(dòng)物，斷頭取腦，冰凍切片，行免疫熒光單、雙標(biāo)染色鑒別移植來(lái)源的細(xì)胞，觀察細(xì)胞遷移、分布及分化情況。 計(jì)算機(jī)輔助計(jì)數(shù)(ImagePro；Media Cybergenics，Silvet Spring，MD)腦組織內(nèi)的BrdU陽(yáng)性移植細(xì)胞，半定量計(jì)算宿主腦內(nèi)的移植細(xì)胞數(shù)以及來(lái)源于移植細(xì)胞的MAP-2、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。 行HE染色測(cè)定各組大鼠腦出血病灶體積大小，評(píng)估神經(jīng)干細(xì)胞移植后對(duì)

9、腦出血病灶大小改變的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．原代和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞球呈nestin陽(yáng)性，并且能夠分化為MAP．2陽(yáng)性的神經(jīng)元、GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞及MBP陽(yáng)性的少突膠質(zhì)細(xì)胞，證實(shí)成功培養(yǎng)獲得具備自我更新和多向分化能力的神經(jīng)干細(xì)胞。 與胰酶消化法進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞球傳代相比，逐步減小吸管口徑機(jī)械分離大細(xì)胞球?yàn)樾〖?xì)胞球和單細(xì)胞的傳代方法，傳代后細(xì)胞存活率高(p<0.05)，細(xì)胞倍增時(shí)間短，增殖能力強(qiáng)。 體外長(zhǎng)

10、期培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的比例逐漸降低，星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例逐漸增高；然而，在4代到12代之間神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的能力雖然表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，但仍較為穩(wěn)定，培養(yǎng)至12代之后，神經(jīng)元的分化比例迅速下降，星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例迅速上升。 2．實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后左側(cè)肢體癱瘓，前后肢行動(dòng)遲緩，抓持能力減弱，活動(dòng)時(shí)向右側(cè)旋轉(zhuǎn)和/或左側(cè)傾倒，穿越橫梁時(shí)，行動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)或不能穿越掉下橫梁，24小時(shí)之內(nèi)功能缺損達(dá)到頂峰

11、。與之相比，對(duì)照組大鼠術(shù)后僅可見(jiàn)輕微功能損害，于1天之內(nèi)逐漸恢復(fù)。兩組之間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.0001)。 術(shù)后第一天，實(shí)驗(yàn)組大鼠右側(cè)尾狀核區(qū)形成一明顯圓形或橢圓形的血腫，血腫周邊有一狹窄而不規(guī)則的水腫帶。術(shù)后2-4天時(shí)，周?chē)[十分明顯，隨后逐漸減輕。對(duì)照組大鼠僅術(shù)后最初2天可見(jiàn)注射點(diǎn)周?chē)^狹窄范圍輕微水腫，未觀察到血腫形成。實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織含水量顯著高于對(duì)照組大鼠腦組織含水量(p<0.001) 腦組織切片HE染色，實(shí)

12、驗(yàn)組大鼠血腫區(qū)內(nèi)充滿大量的紅細(xì)胞，其中可見(jiàn)血腫破壞腦組織；血腫周?chē)哪X組織疏散，細(xì)胞水腫，星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，神經(jīng)細(xì)胞變性壞死，很多中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞充盈其中。對(duì)照組大鼠未見(jiàn)明顯異常。 3．腦出血后第9周始，與對(duì)照相比，NSCs移植組大鼠行為功能改善明顯(ANOVAp<0.05)，SNK檢驗(yàn)顯示，腦出血第7天移植組在移植后第3周和ICH后第9周的行為功能評(píng)分顯著優(yōu)于其他時(shí)間移植組(p<0.05)；在同一時(shí)間點(diǎn)上，ICH后第2天

13、和第14天接受移植大鼠行為功能評(píng)分低于晚期接受移植組，而第14天接受移植組大鼠行為功能改善又好于第2天接受移植組大鼠(p<0.05)；第21和第28天移植組大鼠未見(jiàn)明顯治療效果(p>0.05)，兩組間亦未有顯著性差異(p>0.05)。 BrdU標(biāo)記的移植細(xì)胞遷移進(jìn)入并存活于宿主腦內(nèi)；并且絕大多數(shù)移植細(xì)胞選擇性的靶向遷移到損傷區(qū)，較為均勻的分布于血腫周邊腦組織；少數(shù)細(xì)胞分布于對(duì)側(cè)半球及同側(cè)正常腦組織內(nèi)。 遷移并存活于宿主腦

14、內(nèi)的Brdu陽(yáng)性移植細(xì)胞數(shù)量取決于移植時(shí)間。ICH后第7天和第14天移植組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著多于ICH后第2天、第21天和第28天移植組，且第7天移植組多于第14天移植組。 移植的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞分化為GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和MAP-2陽(yáng)性神經(jīng)元，未觀察到移植細(xì)胞分化為MBP陽(yáng)性少突膠質(zhì)細(xì)胞。 細(xì)胞的分化方向與移植時(shí)間明顯相關(guān)。與其他時(shí)間移植的細(xì)胞相比，ICH后第2天移植的NSCs絕大部分分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞(84

15、.5±7.6﹪)，少部分細(xì)胞分化為神經(jīng)元(8.6±1.3﹪)；而ICH后第21和27天移植的NSCs分化為神經(jīng)元的比例明顯增大(35.4±3.1﹪，37.2±4.1﹪)，分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例相應(yīng)減少(52.1±6.5﹪，50.3±5.7﹪)。然而，7-14天移植組，分化為神經(jīng)元的絕對(duì)數(shù)量顯著高于其它治療組(p<0.0001)。 與對(duì)照相比，移植組大鼠病灶體積未見(jiàn)明顯縮小(p>0.05)，提示NSCs移植在腦出血后第8周未能有

16、效修復(fù)病灶體積。 結(jié)論： 1．與胰酶消化法相比，應(yīng)用逐步減小吸管口徑機(jī)械分離大細(xì)胞球?yàn)樾〖?xì)胞球和單細(xì)胞的分離傳代方法，減少了傳代對(duì)細(xì)胞的損傷，保證了大部分細(xì)胞間連接的完整性，顯著增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力。體外長(zhǎng)期擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞，由于微環(huán)境和/或自身基因的調(diào)控，隨著傳代的延續(xù)，其神經(jīng)發(fā)生能力逐漸降低：分化為神經(jīng)元的比例逐漸減少，分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例逐漸增加。 2．Ⅶ型膠原酶/肝素尾狀核內(nèi)立體定向注射的方法，制

17、作ICH動(dòng)物模型，術(shù)后大鼠產(chǎn)生明顯的、長(zhǎng)期行為功能障礙，不同的個(gè)體之間神經(jīng)病學(xué)評(píng)分差距較小，并且血腫形態(tài)較為一致，對(duì)于研究腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)和治療療效評(píng)價(jià)有利。 3．由于腦出血后病灶周?chē)X屏障的破壞、細(xì)胞因子的表達(dá)；頸動(dòng)脈注射后局部細(xì)胞濃度梯度的作用以及神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)顱內(nèi)病理改變的趨向作用，經(jīng)皮頸動(dòng)脈神經(jīng)干細(xì)胞移植能夠靶向的、高效的將神經(jīng)干細(xì)胞移植至病灶周?chē)⑶覄?chuàng)傷小、手術(shù)簡(jiǎn)單易于操作。 神經(jīng)干細(xì)胞移植時(shí)間影響移植