Mfn2的P21Ras結(jié)構(gòu)域?qū)ζ湟种迫橄侔㎝CF-7細胞增殖功能的影響.pdf

1、目的:
　　線粒體融合蛋白2(mitofusin2，Mfn2)是一種對多種惡性腫瘤細胞具有增殖抑制功能的新基因。我們的前期研究證實與正常乳腺細胞相比，Mfn2在乳腺癌細胞內(nèi)呈低表達，轉(zhuǎn)染外源性Mfn2可抑制乳腺癌細胞增殖。本課題旨在研究Mfn2蛋白的P21Ras結(jié)構(gòu)域?qū)ζ湟种迫橄侔┘毎鲋彻δ艿闹匾约翱赡艿臋C制。
　　方法:
　　實驗設(shè)置4個組，分別為Mfn2組（轉(zhuǎn)染攜帶 Mfn2基因開放閱讀框序列的pEGFP-Mf

2、n2質(zhì)粒）、Mfn2-△P21Ras組（轉(zhuǎn)染攜帶去除P21Ras結(jié)構(gòu)域后的Mfn2基因開放閱讀框序列的pEGFP-Mfn2-△P21Ras質(zhì)粒）、N1組（轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒pEGFP-N1）和Mock組（未轉(zhuǎn)染組）。
　　1.分別構(gòu)建pEGFP-Mfn2和pEGFP-Mfn2-△P21Ras質(zhì)粒，經(jīng)測序驗證后將質(zhì)粒分別導入體外培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞中。培養(yǎng)48h后，用熒光顯微鏡觀察EGFP熒光蛋白的表達，以驗證轉(zhuǎn)染是否成功。

3、>　　2.轉(zhuǎn)染48h后，應用實時熒光定量PCR（FQ-PCR）法和免疫細胞化學法檢測各組MCF-7細胞中 Mfn2的mRNA和蛋白水平的變化。
　　3.轉(zhuǎn)染48h后，應用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法測定各組 MCF-7細胞的增殖活性；流式細胞法分析各組細胞周期的變化情況。
　　4.轉(zhuǎn)染48h后，應用 FQ-PCR法和免疫細胞化學法檢測各組MCF-7細胞中細胞周期蛋白Cyclin E的mRNA和蛋白水平的變化。
　　5.用

4、Western blot法檢測各組中Ras通路中的重要信號分子—磷酸化激活ERK1/2（p-ERK1/2）的蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1.除Mock組外，熒光顯微鏡下其余三組細胞內(nèi)均可見EGFP的綠色熒光，證實各組質(zhì)粒成功導入MCF-7細胞。
　　2.FQ-PCR和免疫細胞化學結(jié)果顯示，與Mock和N1組相比，Mfn2組和Mfn2-△P21Ras組中Mfn2的mRNA及蛋白的表達水平明顯增高（P<0.05）；Mfn2

5、組和Mfn2-△P21Ras組間無差異（P>0.05）。這提示質(zhì)粒攜帶的外源性 Mfn2在 MCF-7細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)錄和翻譯。
　　3.MTT結(jié)果顯示，Mfn2-△P21Ras組的細胞增殖率與 Mock和N1組的相似，顯著高于Mfn2組（P<0.05）；流式細胞法分析顯示，Mfn2組的細胞周期多阻滯在G1/G0期，與之相比，Mfn2-△P21Ras組的G1期細胞顯著減少（P<0.05），Mfn2-△P21Ras組的細胞周期分布與Moc

6、k和N1組相似（P>0.05）。這些結(jié)果顯示，Mfn2-△P21Ras組的Mfn2失去了抑制MCF-7細胞增殖的能力。
　　4.FQ-PCR的結(jié)果顯示，各組間Cyclin E的mRNA水平無顯著差異，而免疫細胞化學結(jié)果顯示，Mfn2-△P21Ras組的Cyclin E蛋白水平與Mock和N1組的相似，顯著高于Mfn2組（P>0.05）。這提示，Mfn2抑制細胞增殖的能力可能與其下調(diào)Cyclin E蛋白水平有關(guān)。但是去除P21Ras

7、的Mfn2失去調(diào)控Cyclin E蛋白表達的能力。
　　5.Western blot結(jié)果顯示，Mfn2-△P21Ras組的p-ERK1/2蛋白水平與Mock和N1組的相似，顯著高于Mfn2組（P<0.05）。這提示 Mfn2可能有調(diào)控ERK1/2蛋白磷酸化的作用，而 Mfn2-△P21Ras蛋白則失去了此功能。
　　結(jié)論:
　　1.Mfn2過表達可能是通過阻止ERK1/2蛋白的磷酸化，進而下調(diào)ERK1/2蛋白的下游基因