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文檔簡介
1、目的:
線粒體融合蛋白2(mitofusin2,Mfn2)是一種對多種惡性腫瘤細胞具有增殖抑制功能的新基因。我們的前期研究證實與正常乳腺細胞相比,Mfn2在乳腺癌細胞內呈低表達,轉染外源性Mfn2可抑制乳腺癌細胞增殖。本課題旨在研究Mfn2蛋白的P21Ras結構域對其抑制乳腺癌細胞增殖功能的重要性及可能的機制。
方法:
實驗設置4個組,分別為Mfn2組(轉染攜帶 Mfn2基因開放閱讀框序列的pEGFP-Mf
2、n2質粒)、Mfn2-△P21Ras組(轉染攜帶去除P21Ras結構域后的Mfn2基因開放閱讀框序列的pEGFP-Mfn2-△P21Ras質粒)、N1組(轉染空白質粒pEGFP-N1)和Mock組(未轉染組)。
1.分別構建pEGFP-Mfn2和pEGFP-Mfn2-△P21Ras質粒,經(jīng)測序驗證后將質粒分別導入體外培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細胞中。培養(yǎng)48h后,用熒光顯微鏡觀察EGFP熒光蛋白的表達,以驗證轉染是否成功。
3、> 2.轉染48h后,應用實時熒光定量PCR(FQ-PCR)法和免疫細胞化學法檢測各組MCF-7細胞中 Mfn2的mRNA和蛋白水平的變化。
3.轉染48h后,應用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定各組 MCF-7細胞的增殖活性;流式細胞法分析各組細胞周期的變化情況。
4.轉染48h后,應用 FQ-PCR法和免疫細胞化學法檢測各組MCF-7細胞中細胞周期蛋白Cyclin E的mRNA和蛋白水平的變化。
5.用
4、Western blot法檢測各組中Ras通路中的重要信號分子—磷酸化激活ERK1/2(p-ERK1/2)的蛋白水平。
結果:
1.除Mock組外,熒光顯微鏡下其余三組細胞內均可見EGFP的綠色熒光,證實各組質粒成功導入MCF-7細胞。
2.FQ-PCR和免疫細胞化學結果顯示,與Mock和N1組相比,Mfn2組和Mfn2-△P21Ras組中Mfn2的mRNA及蛋白的表達水平明顯增高(P<0.05);Mfn2
5、組和Mfn2-△P21Ras組間無差異(P>0.05)。這提示質粒攜帶的外源性 Mfn2在 MCF-7細胞內被轉錄和翻譯。
3.MTT結果顯示,Mfn2-△P21Ras組的細胞增殖率與 Mock和N1組的相似,顯著高于Mfn2組(P<0.05);流式細胞法分析顯示,Mfn2組的細胞周期多阻滯在G1/G0期,與之相比,Mfn2-△P21Ras組的G1期細胞顯著減少(P<0.05),Mfn2-△P21Ras組的細胞周期分布與Moc
6、k和N1組相似(P>0.05)。這些結果顯示,Mfn2-△P21Ras組的Mfn2失去了抑制MCF-7細胞增殖的能力。
4.FQ-PCR的結果顯示,各組間Cyclin E的mRNA水平無顯著差異,而免疫細胞化學結果顯示,Mfn2-△P21Ras組的Cyclin E蛋白水平與Mock和N1組的相似,顯著高于Mfn2組(P>0.05)。這提示,Mfn2抑制細胞增殖的能力可能與其下調Cyclin E蛋白水平有關。但是去除P21Ras
7、的Mfn2失去調控Cyclin E蛋白表達的能力。
5.Western blot結果顯示,Mfn2-△P21Ras組的p-ERK1/2蛋白水平與Mock和N1組的相似,顯著高于Mfn2組(P<0.05)。這提示 Mfn2可能有調控ERK1/2蛋白磷酸化的作用,而 Mfn2-△P21Ras蛋白則失去了此功能。
結論:
1.Mfn2過表達可能是通過阻止ERK1/2蛋白的磷酸化,進而下調ERK1/2蛋白的下游基因
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