纈沙坦對糖尿病大鼠腦組織AGE-RAGE、氧化應(yīng)激及內(nèi)皮功能的影響.pdf

1、研究背景： 糖尿病是以胰島素分泌缺乏、胰島素抵抗或兩者兼有，而致高血糖為特征的一種常見的多發(fā)的內(nèi)分泌代謝性疾病。 糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制一直是研究熱點，氧化應(yīng)激是糖尿病并發(fā)癥的重要發(fā)病機制之一?；钚匝?ROS)產(chǎn)生增多的同時，糖尿病還可以影響清除自由基的各種抗氧化酶的活性及表達，干擾和滅活NO，導(dǎo)致NO生物利用度降低，引起內(nèi)皮功能不全，從而引起靶器官的損害。 此外，晚期糖基化終未產(chǎn)物(AGE)及其受體(RAGE)

2、在糖尿病并發(fā)癥的病理過程中起主要作用。RAGE與AGE結(jié)合后活化，以及它的下游信號及隨后的氧化應(yīng)激反應(yīng)和促炎癥反應(yīng)，促進了糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。糖尿病狀念下，AGE表達增強，可以通過激活糜酶旁路促進組織AngⅡ產(chǎn)生，提示AGE能促進局部組織AngⅡ產(chǎn)生增多參與靶器官損害，而RAS系統(tǒng)的過渡激活能進一步提高AGE-RAGE系統(tǒng)的活性。 纈沙坦作為AT1受體拮抗劑，可延緩2型糖尿病患者糖尿病腎病的發(fā)展，并且該作用得益于AT1受體

3、拮抗劑降壓以外的保護作用。此外，纈沙坦有逆轉(zhuǎn)糖尿病心肌病大鼠心肌間質(zhì)纖維化的作用。但目前對纈沙坦是否可延緩糖尿病腦病的發(fā)生和發(fā)展尚不清楚。 鑒于(1)AGE及其RAGE在糖尿病的腎病等并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用； (2)體外研究顯示抗氧化治療能夠抑制RAGE表達，提示氧化應(yīng)激能促進AGE及其RAGE；(3)AT1受體拮抗劑能抑制糖尿病大鼠腎臟AGE及其RAGE表達，并能明顯改善腎功能；(4)AT1受體拮抗劑對血管內(nèi)皮有保護作用

4、。為此，我們設(shè)計該課題：選用糖尿病大鼠模型，應(yīng)用纈沙坦干預(yù)，采用Wastern blot、熒光實時定量RT-PCR、免疫組織化學、比色法等方法，觀察研究糖尿病大鼠腦組織中AGE-RAGE系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能的變化以及纈沙坦對以上指標的影響。 目的： (1)探討糖尿病時大鼠腦組織氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能的改變。(2)探討AGE與RAGE系統(tǒng)在糖尿病腦病進程中的作用。(3)纈沙坦對糖尿病腦病的保護作用及機制探討。 方法

5、： 實驗動物選取8周齡36只清潔級健康雄性Wistar大鼠，體重180～200g，(購于山東大學實驗動物中心)，隨機分為正常對照組(NC組)、糖尿病組(DM組)、糖尿病纈沙坦治療組(DM.V組)，每組12只。模型制備：將DM組及DM.V組大鼠禁食10h后給予一次性腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ，60mg/kg，溶于0.1 mol/L的檸檬酸一檸檬酸鈉緩沖液中pH4.4，濃度1﹪)，NC組僅給予等體積的檸檬酸．檸檬酸鈉緩沖液。72h

6、后，尾靜脈取血，檢測血糖≥16.7mmol/L為模型建立標準。纈沙坦干預(yù)方法：對DM.V組在檢測模型成功1天后給予纈沙坦40mg/(kg·d)，共12周灌胃。NC組、DM組予相應(yīng)體積的蒸餾水灌胃。實驗期間動物給予正常飲食，每2周檢測一次血糖。12周后進行如下檢測：1．測定各組體重、血糖、收縮壓；2．通過Morris水迷宮實驗觀察大鼠認知功能改變情況：3．比色法測定腦組織中羥自由基(OH)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量、超氧化物

7、歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性；4．熒光實時定量RT-PCR法檢測還原型輔酶Ⅱ(NADPH) p47phox mRNA、內(nèi)皮素-1(ET-1)mRNA、NF-κB mRNA表達；5．免疫組化檢測腦組織AGE的表達：6．Wastern blot檢測NF-κB、RAGE的表達。 結(jié)果： 1．處理12周后大鼠體重、血糖和收縮壓測量DM組和DM.V組體重明顯輕于NC組(均P<0.01)，血糖明顯高于NC

8、組(均P<0.01)，DM組與DM.V組間無顯著差異(p>0.05)。DM組收縮壓較NC組和DM.V組升高約30mmHg(P<0.01)，DM.V組與NC組大鼠收縮壓比較無明顯差異(P>0.05)。 2.Morris水迷宮實驗結(jié)果DM組、DM.V組逃避潛伏期較NC組明顯延長(均P<0.01)，DM.V組較DM組明顯縮短(P<0.01)。 3.OH<'->、NO、MDA含量、SOD及GSH-Px活性檢測結(jié)果與NC組比較，

9、DM組OH<'->、MDA水平顯著升高，而NO含量、SOD及GSH-Px活性顯著降低(均P<0.01)；與DM組比較，DM.V組OH<'->、MDA水平顯著降低，而NO含量、SOD及GSH-Px活性顯著升高(均P<0.01)。 4.腦組織ET-1、NADPH氧化酶p47phox、NF-к B的mRNA表達檢測DM組ET-1、NADPH氧化酶p47phox和NF-к B的mRNA表達較NC組顯著上調(diào)，分別達NC組的6.52、4.8

10、9及7.16倍，有明顯差異(均P<0.01)：DM.V組上述指標的mRNA表達分別達NC組的為2.29、2.67及1.80倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與DM組比較，DM.V組上述指標mRNA表達的抑制率分別為35﹪、54.5﹪及25﹪，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 5.各組大鼠海馬HE染色HE染色顯示NC組大鼠海馬CAl區(qū)錐體細胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，數(shù)量豐富，核膜清晰，核仁明顯；DM組大鼠海馬CAl區(qū)錐體細胞排列

11、紊亂、松散，核固縮，數(shù)量較NC組減少；治療組錐體細胞數(shù)量介于兩者之間，排列較整齊，神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)接近正常并且明顯減輕了海馬部分細胞核固縮現(xiàn)象。 6.免疫組化檢測NC組大鼠海馬CAl區(qū)可見AGE在細胞膜及胞漿表達，且表達較弱；DM組大鼠海馬CAl區(qū)AGE表達呈強陽性，陽性細胞呈棕褐色：與DM組相比較，DM.V組AGE表達強度減弱，陽性細胞數(shù)減少。 圖像分析結(jié)果示：DM組AGE的表達指數(shù)明顯高于NC組(P<0.01)；與DM

12、組表達指數(shù)相比，DM.V組AGE的表達降低(P<0.01)。 7.Wastern blot檢測結(jié)果DM組和DM.V組RAGE的蛋白表達水平較NC組升高，分別為NC組的1.79倍(P<0.01)、1.23倍(P>0.05)；與DM組相比，DM.V組RAGE的蛋白表達水平下降，為DM組的68.6﹪(P<0.01)，有明顯差異。 DM組和DM.V組NF-κB的蛋白表達水平較NC組升高，分別為NC組的1.76倍(P<0.01)、

13、1.24倍(P<0.05)；與DM組相比，DM.V組NF-κB的蛋白表達水平下降，為DM組的70.5﹪(P<0.01)，有明顯差異。 結(jié)論： 1.糖尿病腦組織中的NADPH氧化酶的活性明顯上調(diào)，使ROS產(chǎn)生增多，抗氧化酶的活性降低，氧化應(yīng)激水平提高； 2.糖尿病可能促進AGE及RAGE的表達，AGE與RAGE結(jié)合促進氧化應(yīng)激水平提高及NF-κB活化，氧化應(yīng)激水平增高，進一步促進AGE與RAGE生成，打破NO與ET

14、-1問的相對平衡，引起內(nèi)皮功能的損傷，提示AGE-RAGE通路激活、氧化應(yīng)激水平提高和內(nèi)皮功能的損傷是糖尿病腦組織損傷的重要機制； 3.纈沙坦通過阻斷AngⅡ與AT1受體結(jié)合，一方面可能抑制NADPH氧化酶活性，降低腦組織氧化應(yīng)激水平，繼而減少AGE和RAGE表達，AGE-RAGE結(jié)合減少反過來又能降低氧化應(yīng)激水平，減輕炎性反應(yīng)，促進NO生成，減少ET-1的表達，促進內(nèi)皮功能恢復(fù)；另一方面，氧化應(yīng)激水平降低可能直接抑制NF-κB

15、的表達，促進NO與ET-1間相對平衡的恢復(fù)，改善內(nèi)皮功能及腦細胞損傷，逆轉(zhuǎn)認知功能，延緩糖尿病腦病的進展。 意義： 本課題通過運用Wastern blot、熒光實時定量RT-PCR、免疫組織化學、比色法等方法，觀察了纈沙坦干預(yù)前后糖尿病大鼠腦組織中AGE、RAGE、NF-κB、NADPH及ET-1、Otr、NO、MDA、SOD、GSH-Px表達的變化以及大鼠逃避潛伏期的變化，探討了AGE-RAGE通路激活、氧化應(yīng)激和內(nèi)皮