紫杉醇誘導(dǎo)人喉癌多藥耐藥細(xì)胞的特性及其侵襲能力改變的機制.pdf

1、目的：紫杉醇(Taxol)是對多種類型腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用的四環(huán)二萜類化合物,在臨床上已作為一線或后續(xù)藥物治療乳腺癌、轉(zhuǎn)移性卵巢癌及卵巢來源的輸卵管及腹膜腫瘤.近年來,紫杉醇被證實在頭頸部鱗癌治療中亦具有較好的效果,并已被應(yīng)用于多個臨床試驗.但紫杉醇在頭頸部鱗癌治療中也同樣存在的多藥耐藥降低了紫杉醇的抗癌效果,目前相關(guān)的研究較少.本研究以喉癌Hep-2細(xì)胞為親本細(xì)胞,用紫杉醇誘導(dǎo)篩選耐藥細(xì)胞株Hep-2T,研究耐藥細(xì)胞株的多藥耐藥特性

2、,比較和分析兩者之間的差異,為逆轉(zhuǎn)喉癌的多藥耐藥提供理論依據(jù). 方法：用紫杉醇以濃度梯度遞增法誘導(dǎo)篩選喉癌Hep-2細(xì)胞的多藥耐藥細(xì)胞株Hep-2T;比較兩種細(xì)胞形態(tài)學(xué)和倍增時間的差異.以ATP酶檢測法分別檢測兩種細(xì)胞對紫杉醇、多柔比星、吉西它賓、5.FU及順鉑的IC<,50>,從而確定、比較Hep-2T細(xì)胞和IIep-2細(xì)胞的耐藥倍數(shù).流式細(xì)胞術(shù)檢測兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況、細(xì)胞凋亡以及羅丹明聚集情況.另以Hoechst染色

3、法驗證兩種細(xì)胞之間凋亡的差異.以Realtime Quantitative RT-PCR法檢測MDRl和MRPl基因,Western-blotting法檢測MDRl和MRPl蛋白表達(dá)情況. 結(jié)果：Hep-2T細(xì)胞對紫杉醇、多柔比星、吉西它賓、5-FU及順鉑的藥物耐受分別是Hep-2細(xì)胞的104、46.78、1.95、2.50、1.05倍.與Hep-2細(xì)胞比,Hep-2T細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞百分比明顯增多(P<0.05),而G2/

4、M和S期細(xì)胞百分比則明顯減少(both,P<0.051.當(dāng)以紫杉醇對Hep-2細(xì)胞的.IC<,50>濃度干預(yù)時,流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst染色均顯示Hep-2細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例較Hep-2T的明顯增高(45.32±6.47﹪vs.4.26±1.72﹪,P<0.01,flow cytometry),(54.47±8.95﹪Vs.9.84±2.53﹪,P<0.01,Hoechst staining).流式細(xì)胞術(shù)羅丹明聚集分析結(jié)果顯示,Hep

5、-2細(xì)胞羅丹明陽性百分比較Hep-2T明顯增高(99.32+0.18﹪vs.9.45+6.98﹪,P<0.01).Hep-2T細(xì)胞MDRl表達(dá)在基因和蛋白水平明顯高于Hep-2細(xì)胞(P<0.05,P<0.01).MRPl在基因和蛋白水平的表達(dá)辦高于后者(both,P<0.05),但增高程度不如MDR1明顯. 結(jié)論：在探求逆轉(zhuǎn)紫杉醇所致喉癌多藥耐藥的方法及途徑時,應(yīng)著重于MDR1/P-gp;當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用化療藥物時,應(yīng)考慮非P-gp作

6、用底物的藥物及細(xì)胞周期特異性藥物,以防MDR出現(xiàn)所致的化療不敏感. 第二部分 目的：腫瘤多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)和侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤病人治療失敗和死亡的主要原因.目前已有眾多針對MDR和侵襲轉(zhuǎn)移的研究.但大多是分別對MDR和侵襲轉(zhuǎn)移進行研究,腫瘤MDR形成以后可以引起腫瘤的化療不敏感,但是否導(dǎo)致腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移性改變,MDR與侵襲轉(zhuǎn)移是否密切相關(guān),目前相關(guān)的研究較少,僅有部分研究提示

7、兩種現(xiàn)象之間可能存在著某種聯(lián)系,但具體機制尚不清楚.人喉癌尤其是晚期喉癌總體而言對化療不敏感,其原因主要是對化療藥物耐藥,既有原發(fā)的耐藥,也有在用藥過程中所致的繼發(fā)耐藥.同時喉癌也是出現(xiàn)侵襲較多的一種腫瘤.因而針對喉癌研究MDR和侵襲之間的關(guān)系將有重要的意義.VEGF作為內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖的最強有力的刺激因素和血管滲透的誘導(dǎo)者,對腫瘤增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移起著非常重要的作用.VEGF及其受體VEGFR-2可能對腫瘤的MDR存在調(diào)節(jié)作用,但目前

8、相關(guān)的報道也較少.本研究以紫杉醇誘導(dǎo)篩選的人喉癌Hep-2多藥耐藥細(xì)胞株(Hep-2T)為研究對象,研究MDRl/P-gp及VEGFR-2與腫瘤多藥耐藥細(xì)胞侵襲之間的關(guān)系及其機制. 方法：以Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力,分析比較MDR細(xì)胞和非MDR細(xì)胞、加用和不加用VEGF后細(xì)胞侵襲能力的變化;以Realtime Quantitative RT-PCR和Western-blotting分別檢測Hep-2、Hep-2T細(xì)胞V

9、EGFR-2 mRAN和蛋白表達(dá)量;用RNAi抑制Itep-2T細(xì)胞MDR1并以Realtime Quantitative RT-PCR和Western-blotting分別驗證RNAi抑制MDR1的效果;進而用Transwell驗證MDRl/P-gP改變對腫瘤侵襲能力的影響.以SU1498阻斷 VEGFR-2 受體后用 Transwell 驗證其對腫瘤侵襲能力的影響. 結(jié)果：Hep-2T 細(xì)胞的侵襲能力較Hep-2 細(xì)胞明顯增

10、強(P<0.01).加用VEGF的Hep-2細(xì)胞侵襲能力 (0.139±0.041) 較不加用 VEG F的 Hep-2細(xì)胞(0.077±0.021) 增強(P<0.01);VEGF對 Hep-2T 細(xì)胞侵襲能力也具有相同的影響趨勢 (P<0.01).2×2析因?qū)嶒炘O(shè)計方差分析顯示MDR和VEGF之間存在交互影響(P<0.05),MDR和VEGF之間具有協(xié)同作用,使細(xì)胞的侵襲能力明顯提高.Realtime Quantitative RT

11、-PCR檢測顯示Hep-2T細(xì)胞VEGFR-2表達(dá)較Hep-2細(xì)胞增高1.73±0.24倍 (P<0.05);Western-blotting檢測 Hep-2T 細(xì)胞VEGFR-2表達(dá)量較Hep-2細(xì)胞增高1.17倍(P<0.05).SU1498阻斷VEGFR-2受體后,Hep-2T細(xì)胞侵襲能力有明顯的下降(0.137±0.021 vs.0.208±0.018,P<0.01).經(jīng)RNAi抑制Hep-2T細(xì)胞MDR1后MDR1mRNA下降

12、了73.5﹪ (P<0.05),MDR1/P-gP蛋白表達(dá)亦明顯下降 (P<0.01).RNAi抑制Hep-2T細(xì)胞MDR1同時應(yīng)用 SU1498,細(xì)胞的侵襲能力較單用SU1498降低(P<0.05);較單用RNAi也有明顯降低 (P<0.01);相比兩者都不用的Hep-2T細(xì)胞而言也有明顯降低(P<001);2×2析因?qū)嶒炘O(shè)計方差分析顯示RNAi抑制Hep-2T細(xì)胞MDR1和SU1498具有協(xié)同降低Hep-2T細(xì)胞侵襲能力的作用(P<