酶標納米金探針的制備及其檢測蛋白質方法的研究.pdf

1、癌胚抗原(Carc inoembryonic antigen，CEA)是一種人類胚胎抗原決定簇的酸性糖蛋白，國內外已有大量文獻報道，肺癌患者血清CEA水平明顯高于正常對照組和良性肺病組患者，腺癌陽性率最高，因此CEA的監(jiān)測有助于提高對早期肺癌診斷的敏感性(曾顯聲和周燕斌，2007)但肺癌早期患者血清中的CEA含量極低，因此需建立高靈敏度的蛋白質檢測方法。 隨著納米科技的興起，納米金以其獨特的光學和電學性質、良好的穩(wěn)定性、小尺寸和

2、表面效應以及獨特的生物親和性，使其在疾病診斷領域顯示了潛在的價值。目前，有關利用納米金探針檢測蛋白質的方法已有許多報道，但這些方法普遍操作繁瑣費時、儀器昂貴，僅能在少數(shù)實驗室應用。因此有待于進一步開發(fā)一些操作簡便、可以通過普通儀器就可檢測的、仍具有高靈敏度的納米金探針檢測蛋白質的方法。基于此目的，本研究構建了一種新型納米金探針檢測蛋白質的方法：在磁珠上標記捕獲抗體CEA制備磁珠探針，同時利用納米金對生物大分子的物理吸附特性，將檢測抗體C

3、EA與辣根過氧化物酶(Streptavidin-peroxidase，SA-HRP)標記于納米金上制備成納米金探針，檢測過程中，磁珠探針、CEA抗原(檢測目標)、納米金探針三者通過免疫反應形成三明治復合結構，并利用磁珠的磁場效應收集復合結構，然后進行酶促顯色反應，于450nm處進行分光光度檢測，間接測定CEA抗原(檢測目標)的含量，從而實現(xiàn)了通過普通光學儀器對蛋白質進行高靈敏度檢測的目標。就該檢測方法的建立本文主要做了以下一些工作：

4、 1.磁珠探針的標記及表征 2.納米金探針標記方法研究 3.納米金探針微量蛋白質測定方法研究 結論： 1.經熒光顯微鏡檢測表明CEA抗體標記到了磁珠上，且免疫檢測表明標記到磁珠上的抗體仍然具有活性。 2.經最低蛋白穩(wěn)定量實驗確定納米金標記蛋白質的最低穩(wěn)定量為0.6μl。納米金蛋白質檢測方法的高靈敏度依賴于納米金上酶標記數(shù)量的多寡。因此標記納米金時檢測抗體CEA與SA-HRP的加入量要進行試驗優(yōu)

5、化。經試驗表明檢測抗體CEA(V)：SA-HRP(V)的理想比例為0.5μl:5μl/100μl納米金溶膠，在這種比例下既可以得到高的陽性A值而且陰性對照A值也會保持低的水平。另外納米金探針重懸液的選擇對于納米金探針的活性及存儲穩(wěn)定性具有關鍵的影響。經試驗表明50 mM Tris(pH7.8，1.25％蔗糖，0.2％BSA，0.05％PEG，0.05％PVP，0.15％Tween20)可以保持酶標納米金探針的穩(wěn)定性及標記物的蛋白活性和酶

6、活性，是理想的納米金探針重懸液。 3.酶標納米金探針微量蛋白質測定方法反應條件的優(yōu)化：第一步孵育液為10mM PB(PH7.4，1％BSA，5％蔗糖，1％PEG，1％PVP，0.3％ween20)，第二步孵育液為10 mM PBS(PH7.4，0.1％BSA，0.05％Tween20)，酶標納米金的加入量為3μl，兩步孵育的最適時間為第一步孵育時間1h，第二步孵育時間45 min。使用該方法檢測并繪制CEA標準曲線，表明CEA濃