HDL通過(guò)SR-B1介導(dǎo)的PI3K-Akt-eNOS途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞COX-2表達(dá)和PGI2生成.pdf

1、研究背景：動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成（atherothrombosis）已成為心肌梗死、血栓性卒中、及周?chē)芗膊〉榷喾N臨床疾病共同的基本病理過(guò)程。動(dòng)脈粥樣硬化作為一個(gè)慢性病理過(guò)程，在動(dòng)脈粥樣硬化形成早期可以無(wú)臨床癥狀，而在慢性炎癥等因素的刺激下，粥樣斑塊尤其是脆性斑塊可發(fā)生斑塊侵蝕或破裂并繼發(fā)血小板的粘附、活化、聚積，致急性血栓的形成。而體內(nèi)存在有天然的抗血小板活化、聚積的抑制物，這些抑制物在防止動(dòng)脈粥樣硬化及血栓形成過(guò)程中起著重要作用。<

2、br>　　前列環(huán)素（prostacyclin, PGI2）是花生四烯酸經(jīng)環(huán)氧合酶（cyclooxygenase, COX）途徑級(jí)聯(lián)催化而生成的一種脂質(zhì)介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn) PGI2具有強(qiáng)大的擴(kuò)血管作用和抗血小板聚積作用。PGI2與TXA2是迄今已知的具有調(diào)控血小板功能最強(qiáng)的一對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)，PGI2與TXA2之間的平衡是維持正常血液內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的必要條件。目前升高血液中PGI2的水平已成為了臨床上有效抗血栓治療的靶點(diǎn)。
　　環(huán)氧合酶則是

3、花生四烯酸級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)過(guò)程中的一個(gè)重要限速酶，主要有兩個(gè)亞型：結(jié)構(gòu)型(COX-1)和速生型(COX-2)。研究發(fā)現(xiàn) COX-2與動(dòng)脈粥樣硬化有著密切關(guān)系，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中 COX-2的表達(dá)明顯增高，而且斑塊中COX-2/PGES過(guò)度表達(dá)與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性有關(guān)，但也有越來(lái)越多的證據(jù)表明COX-2并不完全對(duì)機(jī)體有害，它能促使炎癥發(fā)生的同時(shí)也有著抗炎、抗纖維化及抗血栓等作用。
　　高密度脂蛋白(high density l

4、ipoprotein, HDL)主要由脂質(zhì)和載脂蛋白成分組成。當(dāng)前，越來(lái)越多的研究顯示HDL具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和血管保護(hù)作用，血漿中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的水平與臨床心血管事件風(fēng)險(xiǎn)性之間存在顯著負(fù)相關(guān)，且研究還發(fā)現(xiàn)血漿中HDL-C的水平與血漿中PGI2穩(wěn)定產(chǎn)物6-keto-PGF1α的水平呈正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)也得以證實(shí)HDL2及HDL3均能劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PGI2的釋放，抑制COX-2活性后PGI2生成減少，且HDL中的磷

5、脂成分，1-磷酸-鞘胺醇（Sphingosine-1-phosphate，S1P），可通過(guò)細(xì)胞膜上的S1P受體介導(dǎo)的p38MAPK/CREB途徑上調(diào)平滑肌細(xì)胞COX-2的表達(dá)與PGI2的釋放。
　　清道夫受體B類(lèi)1型（Scavenger receptor class B type I，SR-B1）作為體內(nèi)HDL的生理性相關(guān)受體，它可與HDL中apoA1進(jìn)行特異性識(shí)別、結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)HDL抗炎、抗血栓、抗氧化、抗內(nèi)皮損傷等作用。HD

6、L與SR-B1受體結(jié)合后可經(jīng)PI3K-Akt/MAPK途徑活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase， eNOS），增加NO的生成以及激活Rac，最終促使內(nèi)皮細(xì)胞形成偽足、遷移，進(jìn)而修復(fù)內(nèi)皮損傷。
　　第一部分 SR-B1在HDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PGI2釋放中的作用
　　目的：SR-B1做為HDL的生理性相關(guān)受體，它是否也在HDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PGI2生成中發(fā)揮作用。故本實(shí)驗(yàn)的目的也

7、就是觀(guān)察SR-B1受體在HDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PGI2釋放過(guò)程中的作用。
　　方法：1.不同濃度（30μ g/ml、60μ g/ml、120μ g/ml）apoA1處理ECV304細(xì)胞24小時(shí)；30μ g/ml apoA1處理不同時(shí)間（3、6、12、24小時(shí)）；30μ g/ml apoA1及1μ mol/L S1P處理內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)。2.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-hSR-B1重組表達(dá)質(zhì)粒48小時(shí)后，30μ g/ml HDL孵育24

8、小時(shí)。3.轉(zhuǎn)染SR-B1 siRNA48小時(shí)后，30μ g/ml HDL孵育24小時(shí)。設(shè)空白組作對(duì)照，以30μ g/ml HDL處理組為陽(yáng)性對(duì)照，熒光顯微鏡下鑒定轉(zhuǎn)染效率；RT-PCR和/（或）Western blot檢測(cè)SR-B1 mRNA與蛋白的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中6-keto-PGF1α的生成。
　　結(jié)果：30μ g/ml apoA1處理12小時(shí)可以使PGI2生成增加，且24小時(shí)達(dá)高峰；而濃度實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在30μ g

9、/ml濃度時(shí)即可見(jiàn)PGI2生成增加，但隨后PGI2生成并沒(méi)有隨apoA1濃度的增高而增加；30μ g/ml HDL、1μ M S1P均能顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞PGI2的釋放，而apoA1雖能增加內(nèi)皮細(xì)胞PGI2的釋放，但其升高的幅度比HDL、S1P要低。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-hSR-B1重組表達(dá)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)SR-B1受體后， Western blot檢測(cè)SR-B1蛋白表達(dá)成功上調(diào)，但過(guò)表達(dá)SR-B1沒(méi)能顯著增加HDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PGI2的

10、生成。RT-PCR、Western blot檢測(cè)SR-B1三對(duì)siRNA序列均能下調(diào)SR-B1 mRNA及蛋白的表達(dá)，但其中以SR-B1 siRNA-S2作用最為明顯，轉(zhuǎn)染SR-B1 siRNA-S248小時(shí)后再與HDL孵育24小時(shí)，能顯著減少HDL所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞PGI2生成。
　　第二部分SR-B1介導(dǎo)HDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PGI2釋放的機(jī)制探討
　　目的：前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SR-B1參與介導(dǎo)HDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PGI2的生成，

11、故本實(shí)驗(yàn)主要探討SR-B1影響HDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞PGI2釋放的可能機(jī)制。
　　方法：1.分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)-hSR-B1重組表達(dá)質(zhì)粒或SR-B1 siRNA48小時(shí)后，30μ g/ml HDL孵育24小時(shí)；2.30μ g/ml apoA1與ECV304內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24小時(shí)；3.分別用25μ mol/L PI3K特異性抑制劑LY294002或50μ mol/L eNOS特異性抑制劑L-NAME預(yù)處理3小時(shí)后，30μ g

12、/ml HDL孵育24小時(shí)?？瞻捉M作為陰性對(duì)照，30μ g/ml HDL處理組為陽(yáng)性對(duì)照，RT-PCR和/（或）Western blot檢測(cè)PGIS、COX-2、CREB及磷酸化CREB的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中COX-2蛋白的表達(dá)；ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中6-keto-PGF1α的生成。
　　結(jié)果：不管是mRNA水平還是蛋白水平，在過(guò)表達(dá)SR-B1后， HDL均不能顯著上調(diào)COX-2的表達(dá)，然而，有趣地是siRNA沉默

13、SR-B1后，可見(jiàn)HDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞COX-2的表達(dá)明顯減少，且免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)能得到相似的結(jié)果。30μ g/ml apoA1孵育內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)后，COX-2表達(dá)亦出現(xiàn)增加。但是，不管是HDL單獨(dú)處理還是過(guò)表達(dá)或沉默SR-B1，PGIS的表達(dá)都沒(méi)有明顯變化。抑制劑單獨(dú)處理細(xì)胞對(duì) PGI2的生成沒(méi)影響，但抑制 PI3K或 eNOS活性后可明顯減少HDL誘導(dǎo)的PGI2生成，其中以抑制PI3K活性后，PGI2生成減少更為顯著；同樣，LY29

14、4002或L-NAME對(duì)HDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞COX-2、磷酸化CREB表達(dá)的影響與影響PGI2的生成呈相同效果，特異性抑制PI3K和特異性抑制eNOS活性均能下調(diào)HDL誘導(dǎo)的COX-2表達(dá)及CREB磷酸化，且同樣以抑制PI3K后下調(diào)幅度更為明顯。
　　結(jié)論：
　　1. HDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞COX-2的表達(dá)與PGI2的釋放部分依賴(lài)HDL受體SR-B1。
　　2.抑制內(nèi)皮細(xì)胞PI3K或eNOS活性可下調(diào)HDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞CR