SDF-1α基因的克隆及其對THP-1細胞的遷移作用.pdf

1、背景：動脈粥樣硬化是一種動脈血管壁慢性炎癥性疾病，其確切機制還未完全闡明，很多因素可促進其發(fā)生發(fā)展。而趨化因子是炎癥的關鍵調節(jié)因子。基質細胞衍生因子SDF-1α（stromal cell derived- factor 1 alpha）是一類具有趨化活性的細胞因子，研究證實它在造血干細胞遷移及歸巢、惡性腫瘤尤其血液腫瘤的浸潤轉移以其HIV感染方面發(fā)揮著重要作用。近幾年來SDF-1α在動脈硬化性疾病中的作用也開始引起重視。 本研究

2、應用RT-PCR法從大鼠血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells,Vsmcs;）中克隆出SDF-1α基因，并對其序列進行初步的生物信息學分析；然后構建EGFP-C1- SDF-1α重組質粒進行亞細胞定位分析；最后構建重組質粒pcDNA3.1-SDF-1α,研究其對單核細胞的趨化作用。 目的：克隆大鼠SDF-1α基因，并對大鼠SDF-1α基因序列進行分析；分析SDF-1α蛋白亞細胞定位；探討重組SDF

3、-1α蛋白對單核細胞的趨化作用。 方法：從大鼠Vsmcs中提取mRNA,用RT-PCR從中擴增出SDF-1α基因,將擴增片段克隆于pMD-T18載體中,轉化DH5α菌；進行藍白篩選后,運用PCR和酶切鑒定并DNA測序；利用生物信息學方法對SDF-1α基因的序列進行分析。構建EGFP-C1- SDF-1α表達載體，酶切鑒定，脂質體轉染法將重組質粒瞬時轉染Ecv304內皮細胞株,48h后用熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白表達；構建重組質粒

4、pcDNA3.1-SDF-1α，脂質體轉染法轉染Ecv304內皮細胞株，經G418篩選陽性克隆，RT-PCR驗證，建立SDF-1α轉基因穩(wěn)定表達細胞系，再用小室遷移實驗來研究SDF-1α對THP-1單核細胞的趨化作用。 結果：PCR擴增得到378bp的基因片段,經酶切初步證實為SDF-1α基因;陽性克隆經篩選鑒定連接有目的基因;目的基因測序結果與GeneBank上序列比較,結果完全一致,表明靶基因成功插入pMD–T；用脂質體轉染

5、法將重組質粒EGFP-C1- SDF-1α瞬時轉染內皮細胞,發(fā)現綠色熒光蛋白主要在細胞質中表達；用脂質體轉染法將重組質粒pcDNA3.1-SDF-1α轉染法轉染內皮細胞，經G418篩選陽性克隆，RT-PCR驗證，表明建立了SDF-1α轉基因穩(wěn)定表達細胞系，小室遷移試驗發(fā)現SDF-1α對THP-1單核細胞的具有明顯趨化作用。 結論：成功克隆了SDF-1α基因，SDF-1α蛋白主要在細胞質中表達，重組的SDF-1α對單核細胞具有趨化