以顆粒酶B為靶向的磁共振對比劑的制備.pdf

1、靶向磁共振成像技術(shù)是近年來產(chǎn)生的新型磁共振成像技術(shù)，它利用磁共振對比劑二乙三胺五乙酸釓(Gd-DTPA)與特異性載體分子如單克隆抗體結(jié)合形成靶向?qū)Ρ葎?。在特異性載體分子的引導(dǎo)下，靶向?qū)Ρ葎┛梢栽谠撦d體分子靶向的器官，機(jī)體某部位或疾病組織特異性濃聚，改變組織中周圍水分子的T1弛豫時(shí)間，從而形成特異性磁共振圖像。同時(shí)，結(jié)合了載體分子的對比劑也可以增加對比劑在組織中的保留時(shí)間，延長增強(qiáng)效果。與傳統(tǒng)磁共振成像比較，靶向磁共振成像技術(shù)具備了較高的

2、敏感性，同時(shí)新合成的靶向?qū)Ρ葎┮材軌蚩朔翘禺愋詫Ρ葎┑膽?yīng)用局限，對于疾病的早期特異性診斷有一定的價(jià)值。目前靶向磁共振技術(shù)的研究在腫瘤學(xué)領(lǐng)域比較活躍，但在其他方面的應(yīng)用還有待深入。眾所周知，移植排斥反應(yīng)具有明顯的免疫反應(yīng)激活與炎癥細(xì)胞浸潤過程，其中也涉及了許多免疫相關(guān)分子的特異性表達(dá)。顆粒酶B(GB)是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的主要效應(yīng)分子，在急性排斥(AR)反應(yīng)中，活化后的T淋巴細(xì)胞釋放顆粒酶B進(jìn)入靶細(xì)胞，激活核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)，使靶

3、細(xì)胞DNA斷裂，引起靶細(xì)胞凋亡，目前許多研究都提示顆粒酶B對于移植腎排斥的早期診斷有一定的臨床價(jià)值。
　　 目的：利用抗顆粒酶B單抗與Gd-DTPA偶聯(lián)，探討其合成的最佳條件，有效性及安全性，以期合成一種新的磁共振對比劑，為移植腎急性排斥反應(yīng)建立更具特異性的早期無創(chuàng)診斷方法。
　　 方法：⑴MRI對比劑Gd-DTPA-GB mAb制備：將DTPABA溶于二甲基酰胺，配成DTPABA溶液，將顆粒酶B抗體與DTPABA混勻，

4、室溫孵育。PD-10柱子純化，測定抗體濃度。GdCl3加入NaAc，取該液加入洗脫液中，室溫震蕩。PD-10柱子純化，收集洗脫液，分裝，4℃存放。⑵鑒定Gd-DTPA-GB mAb對比劑及連接效率：基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)(Voyager-DE ST

5、R4349)光譜測定是否連接并計(jì)算每分子抗體連接的Gd3+數(shù)量。⑶細(xì)胞毒性檢測：收集對數(shù)生長期人類腎小管上皮細(xì)胞，接種于96孔板。37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，分別加入一定濃度梯度的Gd，Gd-DTPA，GdCl3和Gd-DIPA-GB mAb，孵育12小時(shí)，MTT法測定細(xì)胞毒性。⑷Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性檢驗(yàn)：取正常雄性成年SD大鼠甲狀腺組織，常規(guī)石蠟包埋切片，采用ABC法(Avidin-biotin-peroxida

6、se Complex method，卵白素-生物素-過氧化物酶連結(jié)法)，分為實(shí)驗(yàn)組(Gd-DTPA-GB mAb)，陽性對照組(GBmAb)及陰性對照組(PBS)，通過免疫組化法比較三組之間的陽性結(jié)果表達(dá)量，從而判定Gd-DTPA-GB mAb的免疫活性。⑸統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：細(xì)胞毒及免疫組化的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差，組間比較采用t檢驗(yàn)，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05時(shí)差異具有顯著性。
　　

7、 結(jié)果：①M(fèi)ALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果顯示顆粒酶B單抗的質(zhì)荷比高峰主要出現(xiàn)在133986.41處，而連接了Gd-DTPA后，高峰主要在139736.06的位置出現(xiàn)；根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果計(jì)算得每分子抗體可以連接20個(gè)左右的Gd3+；②MTT法結(jié)果顯示Gd，DTPA，Gd-DTPA以及Gd-DTPA-GB mAb組在濃度逐漸遞增的情況下對于細(xì)胞活性沒有明顯影響，且四組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)：③免疫組化結(jié)果顯示靶向?qū)Ρ葎〨d-DT

8、PA-GB mAb組陽性細(xì)胞數(shù)為13.4±3.12，陽性對照組陽性細(xì)胞數(shù)為14.53±0.81，陰性對照組陽性細(xì)胞數(shù)為0.00±0.00。組間比較采用t檢驗(yàn)，其中陽性對照組，實(shí)驗(yàn)組分別與陰性對照組比較均具有顯著性差異(P<0.0001)，且陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.516)。
　　 結(jié)論：⑴Gd-DTPA能夠通過簡單的螯合反應(yīng)和顆粒酶B單抗以相對較高的濃度結(jié)合，為靶向?qū)Ρ葎┑暮铣商峁┙梃b。⑵MALDI-TOF