芽孢桿菌PY-1的菌種鑒定及其抗真菌產(chǎn)物的分離純化、性質(zhì)研究和結(jié)構(gòu)鑒定.pdf

1、目前的抗生素類藥物主要用于細(xì)菌感染的治療，臨床抗真菌感染仍然缺少特效藥。由于真菌屬于真核生物，與動植物具有相似的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和酶催化體系，因此很多作用于細(xì)菌的抗生素不能作用于真菌，同時，能作用于真菌的藥物又往往對動植物的正常細(xì)胞具有較大的毒性。真菌感染多發(fā)生在病人免疫系統(tǒng)受到破壞，抵抗力下降的情況下，如艾滋病病人、晚期癌癥病人(特別接受放療或化療后)、器官移植病人(使用免疫抑制劑)等，一旦發(fā)生感染常常是致命的。因此研究開發(fā)高效、無毒或低毒的

2、新型抗真菌藥物是一項(xiàng)長期、迫切的任務(wù)。 作為生物機(jī)體天然防御分子的抗菌肽，因?yàn)槠洳煌诂F(xiàn)有抗生素的特殊作用機(jī)制，在對病原微生物強(qiáng)烈的抑制的同時又不易產(chǎn)生耐藥菌群，近來受到人們的極大的關(guān)注。在這些抗菌肽中，有許多具有抗真菌作用。芽孢桿菌PY-l是西南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心從棉花維管束里分離得到的一株對多種動植真菌病病原體都具有強(qiáng)烈抑制作用的拮抗菌，從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了一類有效抗真菌的多肽物質(zhì)并命名為APS。本項(xiàng)研究在鑒定了PY-

3、1菌的具體種屬類別后，以APS為主要對象，摸索其大量純化制備的方法，研究其主要的理化和生物學(xué)性質(zhì)，并以此為基礎(chǔ)鑒定APS的分子結(jié)構(gòu)。 在鑒定PY-l菌的工作中，使用了BD菌種鑒定儀對其進(jìn)行生理生化鑒定；同時應(yīng)用16S rDNA分子鑒定的方法加以證實(shí)：使用芽孢桿菌16SrDNA通用引物擴(kuò)增出PY-1菌的16S rDNA片段，通過瓊脂糖凝膠電泳判斷大小并加以回收；將16S rDNA片段連接入測序質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，通過藍(lán)白斑篩

4、選，挑取陽性克隆進(jìn)行測序；將測得的序列提交到16S rRNA序列分析網(wǎng)站進(jìn)行比對，鑒定PY-1菌的分類，并查找同源性最高的菌株，建立它們之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹。最終兩種鑒定結(jié)果一致判定PY-1菌是一株枯草芽孢桿菌。 對APS的純化，采用了分兩步進(jìn)行的方案：(1)使用酸沉淀、甲醇抽提、分子篩層析的方法制得APS的初提品(后來由溫江發(fā)酵工業(yè)研究所對該法進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化)；(2)使用反相高效液相色譜，對APS實(shí)施精細(xì)純化，得到了五個活性組分(

5、命名APS1-5)。本研究中使用了SephasilPeptide C8、SOLJRCE 15RPC和SOURCE 5RPC三種的反相層析柱對APS的純化條件進(jìn)行摸索，并用Cosmosil C18分析柱分析分離產(chǎn)物的純度；在比較分析了三種層析柱應(yīng)用于APS分離的優(yōu)缺點(diǎn)后，最終確定使用SOURCE 5RPC反相層析柱純化制備大量APS。 純化后的APS對雙縮脲反應(yīng)呈陽性以及酸解后對茚三酮的顯色反應(yīng)，確認(rèn)了其本身氨基酸、肽鍵結(jié)構(gòu)的存在

6、；但天然狀態(tài)APS對茚三酮的陰性反應(yīng)，提示著APS有不同于普通多肽的特殊結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定性測試表明APS具有很高的穩(wěn)定性，它對酸、堿、高溫和變性劑都有很強(qiáng)的耐受性。使用紫外光譜和熒光光譜對APS進(jìn)行了分析：APS在275nm處有特征紫外吸收峰；用277nm激發(fā)光可以使APS產(chǎn)生最強(qiáng)熒光；APS在28lnm激發(fā)光下發(fā)射熒光在307nm處出現(xiàn)最大值，而在295nm的激發(fā)光下基本不產(chǎn)生熒光；這些結(jié)果表明APS有酪氨酸殘基，而無色氨酸殘基，并且酪氨酸

7、殘基位于分子表面直接暴露在水相中。APS具有廣譜的高效抗真菌作用，對多種動植物真菌病原體以及酵母都有優(yōu)于氟康唑的抑制作用，而且APS1-5具有活性增強(qiáng)的趨勢。 以氨基酸組成分析為參考，主要應(yīng)用質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)對APS的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析：使用電噴霧時間飛行質(zhì)譜測定了APS的分子量，從APS卜5分別為1042，1056，1056，1072，1072，猜測五種APS為同系物。選取APSl和APS4進(jìn)行氨基酸組成分析，結(jié)果表明它們的

8、氨基酸組成一樣，即含Asx、Glx、Pro、SeI’和Tyr，比例為3：1：1：1：1，推測五種APS都是相同的氨基酸組成。用高分辨率質(zhì)譜結(jié)果計(jì)算出APSl的合理分子式。結(jié)合氨基酸組成，使用快原子碰撞誘導(dǎo)碎裂串聯(lián)質(zhì)譜(FAB-MS／MS CID)識別APS中的氨基酸殘基，從譜圖中分析出兩套離子碎片，以此判定APS為一類環(huán)肽，并推導(dǎo)出APS的氨基酸序列；由′H-′HCOSY、′H-′H TOCSY、′H-′H NOESY三種核磁共振譜再次