BZAP45基因與黏液表皮樣癌關(guān)系的研究.pdf

1、人涎腺黏液表皮樣癌（MucoepidermoidCarcinoma，MEC）是涎腺最常見的惡性腫瘤，約占涎腺惡性腫瘤的30％，盡管有時表現(xiàn)像良性病變，生長比較慢，但是該腫瘤有時是高度惡性而且預(yù)后很差。低分化的涎腺黏液表皮樣癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力強，5年的存活率不超過43％。
　　對于BZAP45(或BZW1)基因的相關(guān)研究的文獻不多。至今僅知BZAP45是一種調(diào)節(jié)因子。而對于BZAP45基因是否有其他功能并沒有文獻報道，也未見有BZAP

2、45基因與腫瘤相關(guān)的報道。
　　RNA干擾（RNAinterference,RNAi）作用機制為應(yīng)用小的雙鏈RNA引發(fā)序列特異性的基因表達(dá)的“沉默”或“敲除”。在哺乳動物細(xì)胞中這種雙鏈RNA可以是短發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（SmallhairpinRNA，shRNA）；也可以是3'-端帶有游離堿基的簡單的二聚體（SmallinterferenceRNA,siRNA）。轉(zhuǎn)染合成的siRNA所得到的靶基因抑制效果往往時間比較短，而且局限于容易轉(zhuǎn)

3、染的細(xì)胞系。應(yīng)用于RNA干擾的載體有很多種，而利用慢病毒構(gòu)建載體應(yīng)用于基因沉默，是研究基因功能很好的方法。
　　在本課題的前期研究中，我們初步發(fā)現(xiàn)在黏液表皮樣癌組織和細(xì)胞中，BZAP45均高表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本課題構(gòu)建了BZAP45慢病毒干涉載體，將Mc3細(xì)胞中的BZAP45基因沉默，觀察其體外和體內(nèi)生物學(xué)特性的改變，并對其影響Mc3細(xì)胞生物學(xué)行為的機制進行初步探索。本課題主要的研究內(nèi)容包括以下幾個方面：
　　1.進一步確認(rèn)

4、BZAP45基因在黏液表皮樣癌中高表達(dá)
　　為驗證基因芯片結(jié)果正確與否并且明確BZAP45基因是否為黏液表皮樣癌特異性的差異表達(dá)基因，我們設(shè)計了BZAP45基因?qū)崟r定量PCR的引物，進行實時定量PCR檢測；并預(yù)制了BZAP45基因的多克隆抗體，對4例腫瘤組織（制備成15個樣本）和4例正常組織進行了免疫組化染色。結(jié)果顯示，BZAP45基因在黏液表皮樣癌細(xì)胞和組織中表達(dá)均比正常細(xì)胞和組織高。
　　2.BZAP45基因RNA干擾慢

5、病毒載體的制備及黏液表皮樣癌細(xì)胞感染
　　針對靶基因序列，利用公用網(wǎng)站按照RNA干擾序列設(shè)計原則，設(shè)計4個針對BZAP45基因的RNA干擾靶點序列；合成含干擾序列的雙鏈DNAoligo,其兩端含酶切位點粘端，直接連入酶切后的載體上，將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的感受態(tài)細(xì)胞，對長出的陽性克隆先進行PCR鑒定，再進行測序比對后,鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建成功的BZAP45基因RNA干擾慢病毒載體。選擇干涉效果最好的序列，經(jīng)過病毒的小量包裝、大

6、量包裝、滴度檢測及濃縮后獲得足夠滴度的慢病毒溶液，利用慢病毒載體感染Mc3細(xì)胞，利用有限稀釋法挑選陽性單克隆，并利用時定量PCR對獲得的細(xì)胞進行鑒定，從而獲得了穩(wěn)定感染的細(xì)胞株。
　　3.BZAP45基因干涉后Mc3細(xì)胞體外及體內(nèi)生物學(xué)行為的改變
　　為了研究BZAP45基因在Mc3細(xì)胞中可能的作用，我們將BZAP45基因干涉，使其沉默后，利用MTT法、細(xì)胞計數(shù)法、平板克隆形成實驗觀、細(xì)胞劃痕實驗、transwell實驗、H

7、E染色、透射電鏡等方法察Mc3細(xì)胞體外的生物學(xué)行為的變化情況，利用裸鼠移植瘤方法觀察了Mc3細(xì)胞干涉前后在裸鼠體內(nèi)的生長情況。結(jié)果顯示，BZAP45基因沉默后，Mc3細(xì)胞體外增殖變緩，細(xì)胞的群體倍增時間由原來的約23h增為約48h；克隆形成能力下降，克隆形成率由原來的78％下降為20％；體外遷移能力下降，Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三種細(xì)胞遷移的距離分別為65.833±4.940μm、64.733±2.684μm和45.667

8、±3.066μm；體外侵襲能力下降，Mc3、Mc3-NC和Mc3-RNAi三種細(xì)胞到達(dá)小室底面的細(xì)胞數(shù)分別為85±6.1、82.0±7.8和24.0±3.7個；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，干涉后細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、碎裂、邊集于核膜，呈境界清楚的塊狀或半月狀；體內(nèi)成瘤速度變緩，抑瘤率約為57.95％。
　　4.BZAP45影響MC3細(xì)胞生物學(xué)行為的機制初探
　　為研究BZAP45影響MC3細(xì)胞生物學(xué)行為的機制，我們利用流式細(xì)胞儀檢測了干涉

9、前后細(xì)胞周期分布的改變，并利用免疫熒光檢測了細(xì)胞周期相關(guān)因子、凋亡相關(guān)因子以及細(xì)胞增殖相關(guān)因子的表達(dá)改變，結(jié)果顯示，BZAP45基因干涉后，細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，干涉前后p53、c-myc和P21的表達(dá)無明顯變化；干涉后，caspase3的表達(dá)有所升高，而cyclin-D1和PCNA的表達(dá)有所降低。結(jié)論：
　　1.BZAP45基因在黏液表皮樣癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)。
　　2.成功構(gòu)建了BZAP45基因干涉的慢病毒干涉載體。并成功