雙色熒光實時PCR檢測慢性乙肝患者PBMC中HBVcccDNA及其評估拉米夫定療效的價值.pdf

1、慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)引起的最常見的危害性極大的傳染性疾病之一。對慢性乙型肝炎的綜合治療包括抗病毒治療、改善肝功能、抗纖維化及對癥支持治療等。而關鍵是抗病毒治療。目前公認有效的抗HBV治療藥物主要是干擾素和以拉米夫定為代表的新一代核苷類藥物。隨著拉米夫定臨床廣泛應用，在取得一定療效的同時也遇到一些問題，如持續(xù)應答率不滿意、部分病人停藥后復發(fā)、需長期用藥引起的耐藥變異等。如何監(jiān)測拉米夫定抗病

2、毒治療的效果，指導臨床更合理地用藥，成為目前迫切需要解決的一個問題?？共《警熜艿街T多因素的影響，除治療前患者谷丙轉氨酶(ALT)升高和肝臟炎癥活動等因素外，治療過程中細胞內(nèi)乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA(HBVcovalentlyclosedcircularDNA，HBVcccDNA)的存在與變化及機體免疫功能的改變對療效的影響近年來也倍受關注。本文研究了外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcells，P

3、BMCs)中的HBVDNA與HBVcccDNA,和血清Th1/Th2型細胞因子(主要是IL-2、IFN-γ及IL-10)等因素對拉米夫定治療效果的影響，以進一步證實細胞內(nèi)HBVcccDNA與機體免疫功能對拉米夫定療效的評估作用。 第一部分雙色熒光實時PCR法檢測外周血單個核細胞中的HBVDNA與HBVcccDNA目的建立雙色熒光實時PCR(Duplex-ColorRealTimePolymerasechainreaction,D

4、CRT-PCR)體系同步擴增HBV基因組DNA(HBVgenomeDNA)和HBV共價閉合環(huán)狀DNA(HBVcccDNA)的方法，并探討本方法用于檢測外周血單個核細胞(PBMCs)中的HBVDNA的可能性和意義。 方法①先建立一種多重PCR方法(MultiplexPolymerasechainreaction；M-PCR)，即以含HBV全基因序列的質粒pGHBV2、HBV陽性血清及PBMCs提取的DNA為模板，把一套擴增乙肝病毒

5、基因組DNA(HBVgenomeDNA)的引物和一套特異性擴增HBVcccDNA的引物摻入到一個PCR體系中進行反應同時擴增HBVDNA和HBVcccDNA。②在M-PCR反應體系的基礎上，再引入兩條與兩個PCR產(chǎn)物各自相配的熒光探針(兩條探針的熒光基團分別為HEX和FAM)，在icyclerPCR儀上進行熒光實時PCR擴增。③取30例HBV感染患者的全血，常規(guī)分離PBMCs,提取DNA,應用M-PCR及DCRT-PCR方法檢測PBMC

6、s中的HBVDNA與HBVcccDNA。 結果創(chuàng)建的M-PCR及DCRT-PCR方法能同時特異性地分別檢出HBV基因組DNA和HBVcccDNA。M-PCR法檢測30份慢性乙型肝炎患者的PBMCsDNA標本，結果檢出HBV基因組DNA者28例(28/30，93.3％)；HBV基因組DNA與HBVcccDNA同時陽性者23例(23/30，76.6％)；檢出HBVcccDNA者占檢出HBV基因組DNA者的82.1％(23/28)，未

7、發(fā)現(xiàn)單獨的HBVcccDNA陽性者。DCRT-PCR檢測同樣的標本，PBMCs中的HBVDNA與HBVcccDNA檢出率同M-PCR，HBVDNA與HBVcccDNA含量分別為6.81±0.83與3.74±0.37(陽性標本含量對數(shù)值)。 結論成功的創(chuàng)建了能同步檢測HBV基因組DNA與HBVcccDNA的多重PCR及雙色熒光實時PCR方法。慢性乙型肝炎患者的PBMCs中HBVcccDNA陽性率高，進一步證明了在慢性乙肝患者的PB

8、MCs中存在HBV的復制。 第二部分外周血單個核細胞中HBVDNA和HBVcccDNA與慢性乙型肝炎患者拉米夫定治療效果的關系目的探討慢性乙型肝炎拉米夫定治療前后，外周血單個核細胞中HBVDNA和HBVcccDNA檢測與拉米夫定治療效果之間的關系。 方法對17例拉米夫定治療48周，獲得完全或部分療效(血清HBVDNA轉陰，ALT復常，伴或不伴HBeAg血清轉換)的慢性乙型肝炎患者，分別在治療前和治療結束時收集全血標本，采

9、用雙色熒光實時PCR法檢測PBMCs中HBVcccDNA和HBVDNA,并在治療結束后的1年中對他們進行隨訪。 結果在17例拉米夫定治療的患者中，治療前后PBMCs中的HBVDNA分別檢出16例與14例(陰轉2例)，含量分別為6.85±0.94與4.11±1.21(陽性標本含量對數(shù)值)；治療前后PBMCs中的HBVcccDNA分別檢出11例與9例(陰轉2例)，含量分別為3.73±0.44與3.63±0.29。 治療后的H

10、BVDNA含量較治療前明顯下降(下降兩個以上對數(shù)級)，而治療后的HBVcccDNA含量較治療前無顯著性差異(仍在同一對數(shù)級)。治療前PBMCs中的HBVcccDNA占HBVDNA的0.15％，而治療后PBMCs中的HBVcccDNA占HBVDNA的27.9％。 完全應答組(血清抗HBe陽性)的治療前與治療后PBMCs中HBVcccDNA檢出率均明顯低于部分應答組(血清抗HBe陰性)的檢出率(分別為P＜0.05和P＜0.01)；(

11、治療后1年)復發(fā)組(血清HBVDNA陽性)的治療前與治療后PBMCs中HBVcccDNA檢出率均明顯高于未復發(fā)組(血清HBVDNA陰性)的檢出率(分別為P＜0.05和P＜0.01)。 完全應答組拉米夫定治療前PBMCs中HBVDNA含量(5.11±2.32)顯著低于部分應答組(7.38±0.64)(P＜0.05)。 結論拉米夫定對HBVcccDNA抑制作用甚微。 治療前PBMCs中HBVcccDNA的檢測可以作為

12、拉米夫定療效的預測指標之一；治療結束時PBMCs中HBVcccDNA的檢測對拉米夫定治療能否獲得持續(xù)應答具有預測價值。治療前血清與PBMCs中HBVDNA的定量檢測可以作為拉米夫定療效的預測指標之一。PBMCsHBVcccDNA檢測對指導拉米夫定臨床應用的價值優(yōu)于血清與PBMCsHBVDNA檢測。 第三部分血清Th1/Th2型細胞因子與慢性乙型肝炎患者拉米夫定治療效果的關系目的探討慢性乙型肝炎拉米夫定治療前后，血清Th1/Th2

13、型細胞因子水平變化與拉米夫定治療效果之間的關系。 方法選擇接受拉米夫定治療、并在治療12個月后獲得完全或部分療效(血清HBVDNA轉陰，ALT復常，伴或不伴HBeAg血清轉換)的CHB患者17例，分別在治療前、治療后3、6、12個月采用雙抗體夾心ELISA法檢測患者血清IL-2、IFN-γ，IL-10水平。 結果慢性乙肝患者基礎血清IL-2、IFN-γ、IL-10水平均高于健康對照者；所有病例在拉米夫定治療后的血清IL-