雙色熒光實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)慢性乙肝患者PBMC中HBVcccDNA及其評(píng)估拉米夫定療效的價(jià)值.pdf

1、慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)引起的最常見的危害性極大的傳染性疾病之一。對(duì)慢性乙型肝炎的綜合治療包括抗病毒治療、改善肝功能、抗纖維化及對(duì)癥支持治療等。而關(guān)鍵是抗病毒治療。目前公認(rèn)有效的抗HBV治療藥物主要是干擾素和以拉米夫定為代表的新一代核苷類藥物。隨著拉米夫定臨床廣泛應(yīng)用，在取得一定療效的同時(shí)也遇到一些問題，如持續(xù)應(yīng)答率不滿意、部分病人停藥后復(fù)發(fā)、需長期用藥引起的耐藥變異等。如何監(jiān)測(cè)拉米夫定抗病

2、毒治療的效果，指導(dǎo)臨床更合理地用藥，成為目前迫切需要解決的一個(gè)問題。抗病毒療效受到諸多因素的影響，除治療前患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)升高和肝臟炎癥活動(dòng)等因素外，治療過程中細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(HBVcovalentlyclosedcircularDNA，HBVcccDNA)的存在與變化及機(jī)體免疫功能的改變對(duì)療效的影響近年來也倍受關(guān)注。本文研究了外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells，P

3、BMCs)中的HBVDNA與HBVcccDNA,和血清Th1/Th2型細(xì)胞因子(主要是IL-2、IFN-γ及IL-10)等因素對(duì)拉米夫定治療效果的影響，以進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA與機(jī)體免疫功能對(duì)拉米夫定療效的評(píng)估作用。 第一部分雙色熒光實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中的HBVDNA與HBVcccDNA目的建立雙色熒光實(shí)時(shí)PCR(Duplex-ColorRealTimePolymerasechainreaction,D

4、CRT-PCR)體系同步擴(kuò)增HBV基因組DNA(HBVgenomeDNA)和HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(HBVcccDNA)的方法，并探討本方法用于檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中的HBVDNA的可能性和意義。 方法①先建立一種多重PCR方法(MultiplexPolymerasechainreaction；M-PCR)，即以含HBV全基因序列的質(zhì)粒pGHBV2、HBV陽性血清及PBMCs提取的DNA為模板，把一套擴(kuò)增乙肝病毒

5、基因組DNA(HBVgenomeDNA)的引物和一套特異性擴(kuò)增HBVcccDNA的引物摻入到一個(gè)PCR體系中進(jìn)行反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增HBVDNA和HBVcccDNA。②在M-PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，再引入兩條與兩個(gè)PCR產(chǎn)物各自相配的熒光探針(兩條探針的熒光基團(tuán)分別為HEX和FAM)，在icyclerPCR儀上進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增。③取30例HBV感染患者的全血，常規(guī)分離PBMCs,提取DNA,應(yīng)用M-PCR及DCRT-PCR方法檢測(cè)PBMC

6、s中的HBVDNA與HBVcccDNA。 結(jié)果創(chuàng)建的M-PCR及DCRT-PCR方法能同時(shí)特異性地分別檢出HBV基因組DNA和HBVcccDNA。M-PCR法檢測(cè)30份慢性乙型肝炎患者的PBMCsDNA標(biāo)本，結(jié)果檢出HBV基因組DNA者28例(28/30，93.3％)；HBV基因組DNA與HBVcccDNA同時(shí)陽性者23例(23/30，76.6％)；檢出HBVcccDNA者占檢出HBV基因組DNA者的82.1％(23/28)，未

7、發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的HBVcccDNA陽性者。DCRT-PCR檢測(cè)同樣的標(biāo)本，PBMCs中的HBVDNA與HBVcccDNA檢出率同M-PCR，HBVDNA與HBVcccDNA含量分別為6.81±0.83與3.74±0.37(陽性標(biāo)本含量對(duì)數(shù)值)。 結(jié)論成功的創(chuàng)建了能同步檢測(cè)HBV基因組DNA與HBVcccDNA的多重PCR及雙色熒光實(shí)時(shí)PCR方法。慢性乙型肝炎患者的PBMCs中HBVcccDNA陽性率高，進(jìn)一步證明了在慢性乙肝患者的PB

8、MCs中存在HBV的復(fù)制。 第二部分外周血單個(gè)核細(xì)胞中HBVDNA和HBVcccDNA與慢性乙型肝炎患者拉米夫定治療效果的關(guān)系目的探討慢性乙型肝炎拉米夫定治療前后，外周血單個(gè)核細(xì)胞中HBVDNA和HBVcccDNA檢測(cè)與拉米夫定治療效果之間的關(guān)系。 方法對(duì)17例拉米夫定治療48周，獲得完全或部分療效(血清HBVDNA轉(zhuǎn)陰，ALT復(fù)常，伴或不伴HBeAg血清轉(zhuǎn)換)的慢性乙型肝炎患者，分別在治療前和治療結(jié)束時(shí)收集全血標(biāo)本，采

9、用雙色熒光實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)PBMCs中HBVcccDNA和HBVDNA,并在治療結(jié)束后的1年中對(duì)他們進(jìn)行隨訪。 結(jié)果在17例拉米夫定治療的患者中，治療前后PBMCs中的HBVDNA分別檢出16例與14例(陰轉(zhuǎn)2例)，含量分別為6.85±0.94與4.11±1.21(陽性標(biāo)本含量對(duì)數(shù)值)；治療前后PBMCs中的HBVcccDNA分別檢出11例與9例(陰轉(zhuǎn)2例)，含量分別為3.73±0.44與3.63±0.29。 治療后的H

10、BVDNA含量較治療前明顯下降(下降兩個(gè)以上對(duì)數(shù)級(jí))，而治療后的HBVcccDNA含量較治療前無顯著性差異(仍在同一對(duì)數(shù)級(jí))。治療前PBMCs中的HBVcccDNA占HBVDNA的0.15％，而治療后PBMCs中的HBVcccDNA占HBVDNA的27.9％。 完全應(yīng)答組(血清抗HBe陽性)的治療前與治療后PBMCs中HBVcccDNA檢出率均明顯低于部分應(yīng)答組(血清抗HBe陰性)的檢出率(分別為P＜0.05和P＜0.01)；(

11、治療后1年)復(fù)發(fā)組(血清HBVDNA陽性)的治療前與治療后PBMCs中HBVcccDNA檢出率均明顯高于未復(fù)發(fā)組(血清HBVDNA陰性)的檢出率(分別為P＜0.05和P＜0.01)。 完全應(yīng)答組拉米夫定治療前PBMCs中HBVDNA含量(5.11±2.32)顯著低于部分應(yīng)答組(7.38±0.64)(P＜0.05)。 結(jié)論拉米夫定對(duì)HBVcccDNA抑制作用甚微。 治療前PBMCs中HBVcccDNA的檢測(cè)可以作為

12、拉米夫定療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一；治療結(jié)束時(shí)PBMCs中HBVcccDNA的檢測(cè)對(duì)拉米夫定治療能否獲得持續(xù)應(yīng)答具有預(yù)測(cè)價(jià)值。治療前血清與PBMCs中HBVDNA的定量檢測(cè)可以作為拉米夫定療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。PBMCsHBVcccDNA檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)拉米夫定臨床應(yīng)用的價(jià)值優(yōu)于血清與PBMCsHBVDNA檢測(cè)。 第三部分血清Th1/Th2型細(xì)胞因子與慢性乙型肝炎患者拉米夫定治療效果的關(guān)系目的探討慢性乙型肝炎拉米夫定治療前后，血清Th1/Th2

13、型細(xì)胞因子水平變化與拉米夫定治療效果之間的關(guān)系。 方法選擇接受拉米夫定治療、并在治療12個(gè)月后獲得完全或部分療效(血清HBVDNA轉(zhuǎn)陰，ALT復(fù)常，伴或不伴HBeAg血清轉(zhuǎn)換)的CHB患者17例，分別在治療前、治療后3、6、12個(gè)月采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)患者血清IL-2、IFN-γ，IL-10水平。 結(jié)果慢性乙肝患者基礎(chǔ)血清IL-2、IFN-γ、IL-10水平均高于健康對(duì)照者；所有病例在拉米夫定治療后的血清IL-