卵巢癌組織中IL-18、ICE基因表達(dá)及體內(nèi)外抑瘤作用的研究.pdf

1、卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，臨床癥狀隱匿，早期診斷困難，晚期病人療效不佳，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤的首位。其生物學(xué)特征為易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后差，死亡率高。目前對于卵巢癌尚缺乏早期診斷的方法，對其發(fā)病機(jī)制也知之甚少。卵巢癌手術(shù)及化療后的復(fù)發(fā)率很高，所以進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)理，探索新的治療方法具有重要的臨床意義。 白介素18(IL-18)又名干擾素誘導(dǎo)因子，主要由激活的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、表皮細(xì)胞產(chǎn)生，1995年Okamura

2、等在鼠肝中首次發(fā)現(xiàn)。IL-18以非活性的前體蛋白的形式存在，分子量為24KDa，經(jīng)白細(xì)胞介素1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)剪切形成18KDa的成熟蛋白形式而發(fā)揮生物學(xué)作用。IL-18具有抗腫瘤作用，有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用，在結(jié)構(gòu)上與白介素-1相似，在功能上與白介素12相似，能夠刺激T細(xì)胞增殖、增強(qiáng)T細(xì)胞分泌γ-干擾素(IFN-γ)。增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，可誘導(dǎo)活化的Th1細(xì)胞產(chǎn)生大量的IFN-γ，活性比IL-12強(qiáng)。并可能通過抑制血管生成而抑制

3、腫瘤細(xì)胞生長。目前，關(guān)于IL-18、ICE與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及研究IL-18基因轉(zhuǎn)染后對卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，以及應(yīng)用IL-18對卵巢癌進(jìn)行基因治療的研究在國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本課題從三方面進(jìn)行了研究： (1)IL-18、ICE在卵巢癌中的表達(dá)與卵巢癌的病理類型、臨床特點(diǎn)的關(guān)系。(2)采用逆轉(zhuǎn)錄病毒將IL-18基因轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞在體外的生長及IL-18的表達(dá)情況。(3)觀察基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長情況

4、。為探討通過基因治療，阻止卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展，提高生存率，延長生存期奠定理論基礎(chǔ)。 第一部分IL-18、ICE在卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義的研究 目的：探討卵巢癌組織中IL-18及ICE的基因表達(dá)水平，及它們與卵巢癌生物學(xué)特性之間的相互關(guān)系。 結(jié)果：1)卵巢癌組織和正常卵巢組織及卵巢良性腫瘤組織中均有IL-18mRNA的表達(dá)。其IL-18mRNA表達(dá)量分別為0.7746±0.3524、1.3015±0.4778

5、、1.0157±0.1676；ICE在32例卵巢上皮癌組織中有29例表達(dá)；在正常卵巢組織及卵巢良性腫瘤組織中均有表達(dá)，.其mRNA表達(dá)量分別為0.6341±0.3420、0.9614±0.5141、0.7349±0.3429。卵巢上皮癌組織中IL-18及ICEmRNA的表達(dá)較正常卵巢組織明顯減少(P＜0.05)，良性卵巢腫瘤組織中IL-18及ICEmRNA的表達(dá)與正常卵巢組織相比差異無顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論：1)卵巢癌組

6、織中IL-18、ICEmRNA表達(dá)較正常卵巢組織明顯下降，但其表達(dá)水平與患者的年齡、病理類型和臨床分期無關(guān)。人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和3AO均有IL-18mRNA表達(dá)，沒有ICEmRNA的表達(dá)。2)卵巢癌組織中IL-18、ICE蛋白表達(dá)較正常卵巢組織明顯下降；其表達(dá)水平雖與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期無關(guān)，但Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌組織較Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌組織中的表達(dá)有降低趨勢。人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和3AO只有IL-18蛋白表達(dá)，沒有IC

7、E蛋白的表達(dá)。 第二部分IL-18基因轉(zhuǎn)染鼠卵巢癌細(xì)胞體外抑瘤作用的研究 目的：研究轉(zhuǎn)入IL-18基因后對OVHM細(xì)胞的細(xì)胞活性、細(xì)胞增殖周期及細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果：1)分別將逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的有活性的小鼠IL-18基因(PA317/IL-18)及空載體(PA317/LXSN)基因成功轉(zhuǎn)染至OVHM細(xì)胞。得到OVHM/IL-18、OVHM/LXSN細(xì)胞。2)只有OVHM/IL-18細(xì)胞有383bp的IL-18mRN

8、A和IL-18蛋白表達(dá)，而OVHM/LXSN和野生型OVHM細(xì)胞中無IL-18mRNA及蛋白表達(dá)。3)三種細(xì)胞的體外增殖速度無明顯差異。4)轉(zhuǎn)染前后，OVHM/IL-18和OVHM/LXSN細(xì)胞折光性好，貼壁良好，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，基本形態(tài)及生長情況與野生型OVHM細(xì)胞比較無明顯變化。5)OVHM/IL-18、OVHM/LXSN和野生型OVHM細(xì)胞均無明顯凋亡現(xiàn)象，凋亡指數(shù)(APOI)、增殖指數(shù)(PI)、細(xì)胞周期分布無顯著性差異(P＞0.0

9、5)。6)OVHM/IL-18細(xì)胞分泌IL-18水平隨培養(yǎng)時(shí)間的變化而不同，于24小時(shí)達(dá)到高峰，持續(xù)24小時(shí)后其表達(dá)逐漸減弱； 結(jié)論：轉(zhuǎn)染有活性的小鼠IL-18基因的OVHM細(xì)胞表達(dá)IL-18mRNA及蛋白；IL-18基因?qū)δ[瘤細(xì)胞的增殖反應(yīng)無明顯抑制作用，未發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象發(fā)生；OVHM/IL-18細(xì)胞培養(yǎng)上清比OVHM/LXSN、野生型OVHM細(xì)胞能夠明顯的刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，證明轉(zhuǎn)染IL-18基因后的O

10、VHM細(xì)胞可分泌有生理活性的IL-18。 第三部分IL-18基因轉(zhuǎn)染鼠卵巢癌細(xì)胞體內(nèi)抑瘤作用的研究 目的：將IL-18轉(zhuǎn)染OVHM細(xì)胞，在裸鼠體內(nèi)進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)，分析IL-18mRNA在體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。 結(jié)果：1)接種腫瘤細(xì)胞后，連續(xù)觀察4周，OVHM/IL-18組裸鼠右上肢皮下出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤時(shí)間較另兩組晚，平均出瘤時(shí)間為10.5±1.5天，隨瘤齡增長腫瘤生長緩慢OVHM/LXSN與OVHM組平均出瘤

11、時(shí)間為5.5±1.5天、5.4±0.6，隨瘤齡增長腫瘤體積明顯增大；接種后4周腫瘤相繼出現(xiàn)表面破潰，裸鼠出現(xiàn)食欲差，活動(dòng)性差，倦怠等癥狀。3組裸鼠的成瘤率雖然相同；但與OVHM/LXSN和OVHM組裸鼠相比，OVHM/IL-18組裸鼠成瘤潛伏期明顯性延長(P＜0.01)。2)大體觀察：可見OVHM/LXSN組、OVHM組裸鼠瘤組織生長呈結(jié)節(jié)狀，突出于體表，瘤體較大，質(zhì)脆，易出血，浸潤周圍的組織和皮膚，界限不清，不易分離，切面晦暗，無明顯

12、液化及壞死。OVHM/IL-18組裸鼠腫瘤組織體積小，質(zhì)脆，易出血，無明顯周圍組織浸潤，易分離。病理組織切片經(jīng)HE染色鏡下可見對照組和空載體組瘤組織為密集排列的瘤細(xì)胞，間質(zhì)少，細(xì)胞大小不等，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大，深染，大小不一，異型性明顯，核分裂相多見，間質(zhì)血管豐富，偶見脈管瘤栓及腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤。3)OVHM/IL-18組瘤組織中有IL-18的mRNA表達(dá)，而OVHM組及OVHM/LXSN組瘤組織中無IL-18的mRNA表達(dá)。O

13、VHM/IL-18組瘤組織中IL-18陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度顯著高于OVHM/LXSN組和OVHM組裸鼠瘤組織。4)OVHM/IL-18組發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡，而另兩組很少發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。OVHM/IL-18組裸鼠種植瘤細(xì)胞，G0/G1期細(xì)胞明顯增多(88.69±2.52％)，S期細(xì)胞明顯減少(4.82±1.35％)，與OVHM/LXSN組、OVHM組比較有顯著性差異(P＜0.05)。5)OVHM/IL-18組裸鼠體內(nèi)瘤細(xì)胞增殖活性明顯受到抑

14、制。OVHM/IL-18組種植瘤細(xì)胞增殖指數(shù)明顯低于OVHM/LXSN組及OVHM組，有顯著性差異(P＜0.05)。6)經(jīng)電鏡觀察，OVHM/IL-18組裸鼠種植瘤細(xì)胞大而不整形，微絨毛數(shù)量減少，核大而畸形，有凋亡改變，細(xì)胞核固縮，核染色質(zhì)高度濃縮，電子密度增加，呈新月狀邊集于核膜下，核膜完整，核孔消失，胞漿濃縮并有空泡出現(xiàn)，線粒體和其它細(xì)胞器數(shù)量減少，體積變小，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張，有輕度脫顆?，F(xiàn)象。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染IL-18的腫瘤

15、細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)能夠有效的抑制卵巢癌細(xì)胞的成瘤性，增加卵巢癌細(xì)胞的凋亡；但并不能完全抑制腫瘤的生長，這可能緣于下述原因：1)本實(shí)驗(yàn)是用裸鼠制備的動(dòng)物模型，由于裸鼠缺乏胸腺，即T淋巴細(xì)胞免疫系統(tǒng)功能缺乏，而T淋巴細(xì)胞尤其是CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞在IL-18的抗腫瘤活性方面起重要作用，所以，此部分功能缺乏影響IL-18的抗腫瘤作用；2)腫瘤本身存在一些細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)、IL-10等促進(jìn)腫瘤生長，抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞