中國人PSMA蛋白的制備及其Fab噬菌體抗體庫的篩選.pdf

1、目的:該課題擬利用RT-PCR技術(shù),從前列腺癌晚期患者的癌組織中克隆出PSMA的cDNA全長,構(gòu)建其原核表達載體pET30a(+)-PSMA.在IPTG誘導下,誘導表達PSMA,利用親和層析技術(shù),以Ni-NTA樹脂對PSMA進行初步純化.以純化后的PSMA為抗原,對已構(gòu)建的前列腺癌患者噬菌體抗體庫進行篩選,在Elisa檢測鑒定下,挑取高親和力噬菌體抗體克隆,然后以多種腫瘤細胞株為抗原對獲得的抗體克隆進行交叉篩選,獲得與PSMA特異性高效

2、結(jié)合的抗體克隆.從而得到針對PSMA的人源性Fab噬菌體抗體序列,為抗體Fab片段的篩選、動物實驗、臨床試驗奠定基礎(chǔ).研究結(jié)論:1.分段克隆基因,然后將基因在分別連接到同一載體,可以有效解決一些長片段基因克隆中堿基錯配的問題.在國內(nèi)首次成功克隆到序列完全正確的中國人PSMA的cDNA,并構(gòu)建了PSMA的原核表達重組子pET30a(+)-PSMA,為以后的PSMA表達、純化及其抗體庫的篩選奠定了基礎(chǔ).2.用原核表達系統(tǒng)來表達PSMA,由于

3、其分子量大,結(jié)構(gòu)復雜等特點,誘導表達的量較少而且無法確定其生物活性和抗原性,通過SDS-PAGE和Western-Blotting證實,成功獲得了PSMA,并且具有良好的抗原性和特異性.3.用原核表達系統(tǒng)來表達PSMA,由于其分子量大,結(jié)構(gòu)復雜等特點,誘導表達的量較少,這對后期的純化造成較大的困難,通過改變裂解液、沖洗液和洗脫液中咪唑的濃度可以有效提高純化效果.4.由于純化的PSMA純度不夠,這篩選造成一定的影響.但是通過擴大挑取克隆數(shù)