NF-κB在葡萄膜鞏膜房水外流通道的表達及其作用的實驗研究.pdf

1、青光眼目前已成為世界范圍內(nèi)第二位不可逆致盲性眼病。研究青光眼的多中心臨床隨機對照試驗結(jié)果表明，個體化眼壓正常調(diào)控治療仍然是目前阻止病程進展的最有效手段。臨床上青光眼眼壓升高絕大部分是因房水外流阻力增加所致。葡萄膜鞏膜房水流出途徑是房水的兩條重要排出途徑之一，因此，研究葡萄膜鞏膜房水流出通道的分子調(diào)控機制，進一步了解青光眼的發(fā)病機理，豐富青光眼房水流出作用機制理論，為青光眼的治療提供新的、強有力的手段。 研究目的：觀察曲伏前列腺素

2、藥物作用下，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及IκB系統(tǒng)對葡萄膜鞏膜房水外流的分子調(diào)控，以及MMP-2在葡萄膜鞏膜房水外流通道的作用，力圖闡明葡萄膜鞏膜房水外流的分子機制。 研究方法： 1、體外培養(yǎng)人睫狀肌細胞并鑒定。 2、人睫狀肌細胞培養(yǎng)基中加1μM曲伏前列腺素，根據(jù)孵育時間的不同分為4組，即0hr組(對照組)、6hr組、12hr、24hr組。孵育至上述時間點時，分別收取細胞孵育液及細胞，real-timeRT-PCR、和

3、免疫熒光半定量分析分別檢測上述時間組NF-κBp65、IκBα、MMP-2在基因和蛋白水平的表達。Zymography技術(shù)測定MMP-2活性。 研究結(jié)果： 1、人睫狀肌細胞培養(yǎng)和鑒定 1.1光鏡組織塊培養(yǎng)的睫狀肌細胞，1周后細胞開始從組織塊周邊游離出來，呈典型的梭形。組織塊培養(yǎng)細胞融合后，組織塊周圍細胞呈漩渦狀排列，組織塊間細胞呈峰谷樣排列。 1.2細胞用Smoothmuscleα-actin和Desmi

4、n免疫熒光反應(yīng)均可見陽性物質(zhì)分布于胞漿中。形態(tài)學(xué)和免疫熒光鑒定證明所培養(yǎng)的細胞是人睫狀肌細胞。 2、real-timeRT-PCR法分別檢測NF-κBp65、IκBα、MMP-2在不同時間組的基因表達 mRNA相對定量結(jié)果用LSD-t檢驗統(tǒng)計分析顯示與對照組比較6hr、12hr、24hr組NF-κBp65均表達下降(p=0.001)；IκBα熒光強度6hr組、12hr組較對照組改變不明顯(p＞0.05)，24hr組較對照

5、組增加(p=0.000)；MMP-2基因表達6hr組較對照組下降(p=0.000)，12hr、24hr組較對照組逐漸增加趨勢(p=0.000)。 3、免疫熒光半定量分析 相同曝光時間、相同面積下對照組和各實驗組的細胞熒光染色強度應(yīng)用LSD-ttest統(tǒng)計軟件分析表明：NF-κBp65熒光強度6hr、12hr、24hr組均較對照組減少(p=0.000)；Iκ±Bα6hr組較對照組沒有明顯改變(p=0.134)、12hr組較

6、對照組輕微下降(p=0.032)，24hr組較對照組明顯增加(p=0.001)；MMP-2熒光強度6hr組較對照組熒光強度減少(p=0.305)，12hr、24hr組較對照組逐漸升高趨勢(p=0.000)。 4、Zymography(明膠酶譜)技術(shù)檢測各時間組MMP-2的活性 Zymography凝膠中可見一條MMP-2透明條帶，分子量為72kDa，對照組與6hr、12hr、24hr組MMP-2校正光密度值分別為10.2