條滸苔轉化表達系統(tǒng)的構建.pdf

1、本文從三方面對條滸苔轉化表達系統(tǒng)進行研究：條滸苔原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與再生系統(tǒng)研究、條滸苔細胞轉化表達選擇標記的篩選和條滸苔外源基因?qū)肱c轉化表達系統(tǒng)的建立。 本實驗首先建立了條滸苔原生質(zhì)體分離培養(yǎng)與再生技術，探索了條滸苔原生質(zhì)體分離優(yōu)化條件，發(fā)現(xiàn)用酶法獲得條滸苔原生質(zhì)體時，最佳酶液配方為2％纖維素酶混合2％離析酶，最佳酶解pH為6.5，滲透劑甘露醇濃度為0.6M。通過原生質(zhì)體培養(yǎng)，觀察到條滸苔細胞3種再生發(fā)育方式：(1)單細胞可以

2、直接分裂生長形成單細胞苗，有的小苗橫裂為8細胞苗后形成有分枝的苗；(2)某些單細胞以不規(guī)則方式進行分裂，形成細胞團。細胞團中的細胞可以釋放出來形成小苗，并形成小苗簇；(3)某些單細胞分裂只是在原細胞內(nèi)進行，原細胞即成為孢子囊/配子囊，其子細胞不形成壁，即為孢子/配子。一個孢子囊/配子囊中可含有10個以上的子細胞，子細胞大小不均一。高光強(45μmolm-2.s-1)、高溫(20℃)和充氣等外界條件下，條滸苔細胞更易于形成孢子囊/配子囊，

3、并放散孢子/配子。 其次本實驗進行了條滸苔細胞轉化表達選擇標記的篩選，研究表明條滸苔原生質(zhì)體對氯霉素敏感性較高，而對氨芐西林鈉、羧芐西林鈉、硫酸卡那霉素、G-418、硫酸鏈霉素不敏感。當氯霉素濃度高達125μg/ml時，原生質(zhì)體培養(yǎng)兩周大部分死亡。然后比較了條滸苔對氯霉素和除草劑Basta敏感性，采用不同濃度氯霉素(0、25、50、75、100、125μg/ml)和Basta(0、5、12.5、25、37.5、50μg/ml)分

4、別對條滸苔游孢子、小苗和成體葉片細胞的殺生作用進行了檢測，結果表明，在15天內(nèi)氯霉素最大濃度125μg/ml對條滸苔游孢子、小苗和成體葉片細胞均難以達到全部殺死效果，其存活率分別為1％、20％和25％；而Basta對條滸苔具有很強的殺生作用，在12.5μg/ml濃度下，Basta在11天內(nèi)可將條滸苔小苗和成體葉片全部殺死；在25μg/ml濃度下，Basta在7天內(nèi)可將條滸苔小苗和成體葉片全部殺死；對于條滸苔游孢子，5μg/mlBasta

5、3天內(nèi)就可以使其全部死亡。這個結果提示了bar基因有可能成為滸苔基因工程較理想的選擇標記基因。 最后，本實驗開展了條滸苔外源基因?qū)肱c轉化表達系統(tǒng)建立的研究。采用PEG法轉化三種外源DNA分別含有報告基因LacZ基因和GUS基因以及選擇抗性基因bar基因。經(jīng)組織化學染色檢測，LacZ基因未見表達，而GUS基因在第3天獲得瞬間表達。通過40天Basta壓力篩選，轉化藻株仍然具有Basta抗性；對經(jīng)過30天Basta篩選的小苗進行P