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文檔簡介
1、本文比較系統(tǒng)地研究了長石莼(緣管滸苔)細胞轉(zhuǎn)化與表達系統(tǒng):1)長石莼(緣管滸苔)離體細胞再生系統(tǒng)研究;2)長石莼(緣管滸苔)生長關(guān)鍵生態(tài)因子與條件優(yōu)化;3)草丁膦抗性基因(bar)在長石莼(緣管滸苔)細胞中導(dǎo)入與表達;4)綠色熒光蛋白(ZsGreen)基因在長石莼(緣管滸苔)細胞中導(dǎo)入與表達。這為今后建立我國石莼和滸苔的轉(zhuǎn)化與表達系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)。 首先,研究了長石莼(緣管滸苔)離體細胞再生系統(tǒng)以及分化發(fā)育途徑。采用酶解技術(shù)將長石
2、莼(緣管滸苔)葉片細胞分離為單細胞,通過細胞培養(yǎng)觀察離體單細胞再生以及各種分化發(fā)育途徑。研究發(fā)現(xiàn)長石莼(緣管滸苔)主要存在3種分化發(fā)育途徑(6種類型):1)部分原生質(zhì)體可直接分裂形成單細胞苗。其中包括有假根和無假根2種類型。2)部分原生質(zhì)體分裂成細胞團,其中包括不規(guī)則細胞團和規(guī)則細胞團2種類型。不規(guī)則細胞團的子細胞均可直接形成小苗而成苗簇,規(guī)則細胞團囊壁較薄,類似孢子囊/配子囊,但不釋放孢子/配子,而是以子細胞直接萌發(fā)小苗形式發(fā)育,最后
3、形成苗簇。3)部分原生質(zhì)體可發(fā)育為孢子囊/配子囊2種類型,其中部分孢子囊/配子囊成熟后釋放出游孢子/配子,孢子直接形成小苗,而配子可進一步接合為合子直接形成小苗。大部分配子是以正面結(jié)合,少數(shù)也可以首尾交錯結(jié)合。并觀察到某些配子也可直接形成小苗。 其次,利用脈沖振幅調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x研究了不同光照和溫度對長石莼(緣管滸苔)藻體生長及光合作用的影響,進而對藻體生長培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明,長石莼(緣管滸苔)在25℃和72μmol·
4、m-2·s-1條件下,其Fv/Fm、Fm、Fv、α和生長率值最高,分別高達0.74、4567、3406、0.305和228%,低于該點為光不飽和,高于為光抑制,偏離越大,光合作用和生長越受影響,下降越顯著(P<0.01),其中在5℃和35℃時最小,分別是25℃最高值的9.88-64.88%和22.99-53.44%;光強為18μmol·m-2·s-1和216μmol·m-2·s-1時最小,其Fv/Fm、Fm、Fv、α和生長率分別是25℃
5、72μmol·m-2·s-1最高值的7.02-82.62%和51.82-76.72%。F0變化不太明顯,5-30℃為先上升后下降或再上升變化趨勢,35℃為先下降后上升變化趨勢。擬合參數(shù)α顯示,長石莼(緣管滸苔)在達到光飽和點前通過增加光能吸收來增強光合作用,在光抑制后則迅速減少。rETRmax Duncan檢驗表明,高溫/低溫和高光強對長石莼(緣管滸苔)光合作用影響顯著(P<0.01)??傮w上看,長石莼(緣管滸苔)光合作用和生長適宜條件
6、為15-25℃和54-72μmol·m-2·s-1,過高或過低均不適宜,且溫度排序為25>20>15>30>10>5>35℃,光照強度排序為72>54/108>36/162>18/216μmol·m-2·s-1。 再次,通過PEG法介導(dǎo)將含有bar抗性篩選基因的pSVB載體導(dǎo)入到原生質(zhì)體中并獲得穩(wěn)定表達,成功地建立了bar基因抗性篩選轉(zhuǎn)化體系。將構(gòu)建的含有bar抗性篩選基因(啟動子為SV40)的pSVB載體通過PEG法介導(dǎo)導(dǎo)入到
7、Ulva linza原生質(zhì)體中,通過細胞培養(yǎng)再生成株。1周后用含有5ppm BastaVSE培養(yǎng)液進行壓力篩選,成功篩選到抗Basta的轉(zhuǎn)化細胞(或藻株),且相對轉(zhuǎn)化率達到了31.58%。繼續(xù)將含Basta VSE培養(yǎng)液對轉(zhuǎn)化小苗進行壓力篩選,并從中挑選出陽性藻株進行bar基因PCR分子檢測,發(fā)現(xiàn)壓力篩選1個月和12個月的轉(zhuǎn)化藻體總DNA均得到了預(yù)期的陽性信號,其序列與GenBank中一致;進一步用Southern雜交檢測,也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化藻
8、株基因組DNA中同樣獲得陽性信號。表明bar抗性篩選基因在啟動子SV40作用下可以獲得瞬間表達,并也獲得了穩(wěn)定表達,成功建立了轉(zhuǎn)基因藻株的抗性篩選體系。 最后,利用構(gòu)建的含有綠色熒光蛋白基因達到載體PSV-bar-ZsGreen導(dǎo)入到原生質(zhì)體中并得到表達,以建立轉(zhuǎn)基因藻株綠色熒光蛋白檢測體系。應(yīng)用PCR方法擴增了pZsGreen1-N1質(zhì)粒熒光蛋白片段,并構(gòu)建了帶綠色熒光蛋白ZsGreen為檢測基因的表達載體PSV-bar-Zs
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