氨基糖甙類藥物對無義突變的HERG通道的藥物拯救研究.pdf

1、目的：檢測無義突變HERG通道的表達(dá)水平；探討氨基糖甙類抗生素G—418和慶大霉素在異源表達(dá)系統(tǒng)中對導(dǎo)致LQT2的無義突變的純合的HERG通道的作用，分析同一種氨基糖甙類藥物對不同突變體作用差異性的原因；闡明HERG基因無義突變致LQT2的發(fā)病機(jī)制；探討不同氨基糖甙類藥物對雜合的HERG通道的干預(yù)效應(yīng)，評價(jià)不同氨基糖甙類藥物對某一種HERG通道的作用差異性；檢測氨基糖甙類藥物對存在轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷的錯(cuò)義突變體是否具有拯救效應(yīng)。 方法：①

2、采用聚合酶鏈反應(yīng)法制備四種HERG C末端無義突變體—R1014X、W927X、R863X和E698X，并克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體中。將野生型(WT) HERG和四種無義突變體的質(zhì)粒擴(kuò)增、純化，然后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞，同時(shí)共轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)基因作為目的基因轉(zhuǎn)染成功的標(biāo)志物。配制記錄HERG通道電流所需的電極內(nèi)液、外液，設(shè)置HERG通道穩(wěn)態(tài)激活的電流—電壓關(guān)系曲線(Ⅰ—Ⅴ曲線)的刺激參數(shù)。在轉(zhuǎn)染了目的質(zhì)粒36～48h

3、后的HEK293細(xì)胞上，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄通道電流。藥物拯救采用將轉(zhuǎn)染24h后的HEK293細(xì)胞在含G—418或慶大霉素(終濃度為400μg/ml)的培養(yǎng)基中孵育24h。在膜片鉗記錄前，換用不含藥物的培養(yǎng)基洗脫1h。②采用western blot的方法檢測野生型和突變的HERG通道蛋白的表達(dá)情況，觀察突變體是否產(chǎn)生截短的通道蛋白、是否存在轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷等。應(yīng)用HERG通道N端抗體檢測藥物干預(yù)前通道蛋白的表達(dá)，應(yīng)用HERG通道C端抗體檢測

4、藥物干預(yù)后通道蛋白的表達(dá)。③制作HEK293細(xì)胞爬片，應(yīng)用共聚焦顯微鏡定性檢測野生型和突變的HERG通道蛋白在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)的分布情況，觀察突變體是否會產(chǎn)生免疫熒光、熒光主要分布在胞膜還是胞漿等。應(yīng)用HERG通道N端抗體檢測藥物干預(yù)前突變通道蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布，應(yīng)用HERG通道C端抗體檢測藥物干預(yù)后突變通道蛋白的細(xì)胞內(nèi)分布。 結(jié)果：⑴HEK293細(xì)胞表達(dá)模型的建立：HEK293細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)后，貼壁生長良好，呈多邊形類上皮細(xì)

5、胞樣。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用胰酶消化，接種約1×105細(xì)胞于35mm培養(yǎng)皿。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長融合50％～70％時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后36～48小時(shí)在熒光顯微鏡下觀察，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率約為50％～60％，轉(zhuǎn)染陽性的HEK293細(xì)胞帶綠色熒光，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不帶綠色熒光。挑選帶綠色熒光、邊緣清楚、表面光滑、大小適中的細(xì)胞進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。⑵無義突變HERG通道的電流表達(dá)：野生型HERG通道表現(xiàn)出典型的電壓依賴性激活和內(nèi)向整流特性，其

6、最大尾電流密度為47.8±6.3 pA/pF(n=12)。R1014X和W927X突變體均能表達(dá)典型的HERG樣電流，但與野生型HERG通道相比，最大尾電流密度明顯下降(R1014X：3.9±1.4 pA/pF，n=8，P<0.01；W927X：11.6±2.4 pA/pF，n=8，P<0.01)。R863X和E698X突變體僅表達(dá)與未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞上類似的內(nèi)生性電流，在至少8個(gè)細(xì)胞上均未記錄到尾電流，說明二者并不能形成功能性的

7、HERG通道。⑶氨基糖甙類藥物對純合突變的HERG通道的干預(yù)效應(yīng)：氨基糖甙類藥物能增強(qiáng)R1014X和W927X的電流表達(dá)，使其尾電流幅值明顯增加。經(jīng)過400μg/mlG—418和慶大霉素干預(yù)后，R1014X突變體的最大尾電流密度分別增加至12.7±3.3 pA/pF(n=7，P<0.05)和18.3±3.7 pA/pF(n=8，P<0.05)。與野生型HERG通道相比，R1014X的激活曲線左移，通道的半激活電壓更負(fù)；藥物干預(yù)后，其激活

8、動力學(xué)特性亦得到恢復(fù)。慶大霉素干預(yù)對W927X亦有效，其最大尾電流密度增至19.5±2.7 pA/pF(n=7，P<0.05)。通道激活動力學(xué)特征在野生型HERG、W927X和W927X加慶大霉素干預(yù)組均沒有明顯差異。然而，慶大霉素干預(yù)對R863X和E698X突變體并無明顯作用，仍然未能記錄到尾電流，僅表達(dá)內(nèi)生性電流。⑷無義突變通道蛋白的表達(dá)及其在細(xì)胞內(nèi)的分布形式：野生型HERG通道表達(dá)兩個(gè)蛋白條帶約在135KDa和155KDa處，分別

9、代表經(jīng)過核心糖基化后的未成熟蛋白和經(jīng)過復(fù)合糖基化后的成熟蛋白形式。R1014X突變體經(jīng)抗HERG通道N端抗體檢測，顯示兩個(gè)蛋白條帶約在120KDa和140KDa處，說明無義突變產(chǎn)生了截短的通道蛋白。R863X突變體則僅顯示一個(gè)蛋白條帶約在90KDa處，說明R863X不僅產(chǎn)生了截短的通道蛋白，同時(shí)還存在轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷。⑸氨基糖甙類藥物對無義突變HERG通道蛋白的影響：應(yīng)用HERG通道C端抗體檢測藥物干預(yù)的效果。野生型HERG通道仍表達(dá)135KD

10、a和155KDa兩個(gè)蛋白條帶，而R1014X并未顯示任何條帶。經(jīng)G—418和慶大霉素干預(yù)后，出現(xiàn)與野生型通道蛋白位置一致的兩個(gè)蛋白條帶，說明氨基糖甙類藥物誘導(dǎo)了全長的有功能的通道蛋白的表達(dá)。而慶大霉素對存在轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的錯(cuò)義突變體N470D并無明顯作用，說明氨基糖甙類藥物并不能糾正轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷。⑹氨基糖甙類藥物對負(fù)顯性抑制的干預(yù)效應(yīng)：鑒于LQT2呈常染色體顯性遺傳，患者的基因型往往為正常和突變等位基因共存的雜合子，因此進(jìn)一步對雜合通道(WT/R

11、1014X)進(jìn)行檢測。WT/R1014X通道的最大尾電流密度為13.1±2.2pA/pF(n=8)，低于野生型HERG通道的50％，說明R1014X對野生型HERG通道存在負(fù)顯性抑制效應(yīng)。為了驗(yàn)證氨基糖甙類藥物是否能消除此負(fù)顯性效應(yīng)，以400μg/ml G—418和慶大霉素干預(yù)WT/R1014X通道。G—418和慶大霉素對雜合的WT/R1014X通道作用效應(yīng)不同：慶大霉素能使WT/R1014X的最大尾電流密度增加2.2倍(29.2±3.

12、7 pA/pF，n=12，P<(0.05)，G—418卻無明顯效應(yīng)(13.7±1.8pA/pF，n=8，P>0.05)。WT/R1014X通道的激活動力學(xué)特征與野生型HERG相比無明顯差異，藥物干預(yù)對其亦無明顯影響。 結(jié)論：①HERG通道C末端無義突變體是否能表達(dá)功能性的通道電流，取決于其從C末端截短的氨基酸殘基的多少。②氨基糖甙類藥物能增強(qiáng)純合的HERG通道無義突變的功能性表達(dá)，恢復(fù)其通道的電生理特性。③氨基糖甙類藥物能抑制提