酶類藥物的分析

1、1,酶類藥物的分析,第一節(jié) 概述第二節(jié) 酶類藥物的鑒別與檢查第三節(jié) 酶活力測定方法第四節(jié) 酶活力測定方法設(shè)計(jì)第五節(jié) 典型酶類藥物的檢測,2,,。,3,第一節(jié) 概述,在生物體內(nèi)，降低反應(yīng)活化能，加快可逆反應(yīng)的進(jìn)行速度。一、酶的特性二、酶的分類三、酶的化學(xué)組成四、酶的催化反應(yīng)機(jī)制五、酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué),,,4,一、酶的特性,1．酶是高效催化劑。 2．酶對底物的結(jié)構(gòu)具有嚴(yán)格的選擇性。 （1）相對專一性： 脂肪水解

2、酶，蛋白水解酶（2）絕對專一性: 脲酶（3）立體異構(gòu)專一性: L-氨基酸氧化酶3．酶催化反應(yīng)的反應(yīng)條件溫和。4．酶的催化活性在生物體內(nèi)受多種因素的調(diào)節(jié)。,5,。,5,6,二、酶的分類,氧化還原酶轉(zhuǎn)移酶水解酶裂合酶異構(gòu)酶合成酶（或稱連接酶）,7,三、酶的化學(xué)組成,分為簡單酶和結(jié)合酶兩大類。結(jié)合酶類中除含有蛋白外，還含有某種熱穩(wěn)定的非蛋白質(zhì)的小分子物質(zhì)，二者結(jié)合起來，稱為“全酶”，才呈現(xiàn)生物催化活性。

3、結(jié)合酶 = 酶蛋白 + 輔助因子,8,四、酶的催化反應(yīng)機(jī)制,1．酶-底物復(fù)合物的形成 在酶促反應(yīng)中，反應(yīng)底物首先與酶分子上活性部位結(jié)合，形成酶-底物復(fù)合物，降低反應(yīng)的活性能，使酶促反應(yīng)順利進(jìn)行。2．酶-底物復(fù)合物加速反應(yīng)速率的原因（1）定向作用與底物濃縮 （2）酶使底物分子變形 （3）酸堿催化（4）共價(jià)催化 。,9,五、酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué),酶的活力單位 酶活性單位（U）是酶活性高低的一種量度，用U/g或U/ml表示

4、。酶活力單位定義：在規(guī)定的條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化1μmol底物所需要的酶量，稱一個(gè)酶的活力單位。酶的比活力 每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg。,10,Michaelis-Menten快速平衡學(xué)說,底物濃度的增加，反應(yīng)速度上升呈雙曲線。在低底物濃度時(shí)，反應(yīng)速度呈直線上升，表現(xiàn)為一級反應(yīng)。在高濃度時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值，呈現(xiàn)零級反應(yīng)。,,11,米氏方程,酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式：V——反應(yīng)初速度Vm

5、——最大反應(yīng)速度Ks —米氏常數(shù)，Ks=K－1/K1， Ks為ES的解離常數(shù)，表示酶與底物的親和力。Ks為反應(yīng)速度V是最大反應(yīng)速度Vm一半時(shí)所需底物濃度，即V=1/2 Vm時(shí)，Ks=[S]。,12,Briggs-Haldane穩(wěn)態(tài)學(xué)說,ES的形成速度與ES的解離速度相等，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，即“穩(wěn)態(tài)”，反應(yīng)方程式：Km取代了Ks，當(dāng)V=1/2 Vm時(shí)，Km=[S]。Km也表示為底物與酶的親和力。,13,2015版藥典收載的酶原料

6、,胰酶，胃蛋白酶胰蛋白酶，糜蛋白酶，玻璃酸酶尿激酶抑肽酶，門冬酰胺酶,《中國藥典》收載的酶類藥品品種,15,第二節(jié) 酶類藥物的鑒別與檢查,鑒別方法:蛋白質(zhì)鑒別方法，如在堿性條件下的雙縮脲反應(yīng)。SDS-PAGE電泳：降纖酶HPLC：門冬酰胺酶專用于酶的鑒別方法： 酶活性試驗(yàn)：與特異性底物反應(yīng)（胰蛋白酶）。 沉淀試驗(yàn)：胃蛋白酶 動(dòng)物試驗(yàn)：透明質(zhì)酸酶水解粘多糖。,16,酶類藥物的檢查,酶類藥物是生化

7、產(chǎn)品和微生物發(fā)酵產(chǎn)品，在生產(chǎn)過程中可能帶入微量的脂肪類物質(zhì)、其他的酶類和大分子雜質(zhì)，影響酶質(zhì)量，需有含量限度。,17,酶類藥物的檢查,（一）脂肪含量限度檢查檢查方法，乙醚浸提，干燥，精密稱定，脂肪不得過規(guī)定的含量。（二）其他酶類含量限度檢查胰蛋白酶、糜蛋白酶均是從牛、豬的胰臟中提取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶時(shí)又易帶入微量的糜蛋白酶。（三）大分子活性物質(zhì)含量限度檢查,18,胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量,每2500U胰蛋白酶中不得

8、多于50U的糜蛋白酶。糜蛋白酶專屬水解芳香氨基酸（L-酪氨酸、L-苯丙氨酸）的羧基形成的肽鍵、酰胺鍵和酯鍵。用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-Tyrosine Ethylester，ATEE）作底物，通過分光光度法測定此酶對底物的水解速率來檢查該酶的含量限度。,,19,第三節(jié) 酶活力測定方法,固定時(shí)間法 連續(xù)監(jiān)測法 固定濃度法,20,一、固定時(shí)間法 （終點(diǎn)法）,在適宜的條件下，使酶和底物共同保溫一定時(shí)間，測

9、定產(chǎn)物生成的量或底物消耗的量，計(jì)算出酶的含量（或活力）。 [E]表示酶濃度，[P]為反應(yīng)產(chǎn)物濃度，t 表示酶作用時(shí)間，K為常數(shù)。,,21,實(shí)例：,（1）胰彈性蛋白酶活力單位定義：在pH 8.8，37℃條件下作用20min，水解1.0mg剛果紅彈性蛋白的酶量定義為一個(gè)活力單位。 （2）天冬氨酸酶活力單位定義：在測定條件下，每小時(shí)每克細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成1µmol天冬氨酸所需的酶量。,22,注意事項(xiàng),缺點(diǎn)：無法了解整個(gè)反應(yīng)過

10、程是否都是零級反應(yīng)。注意事項(xiàng)：1、底物飽和2、時(shí)間,23,二、連續(xù)監(jiān)測法（反應(yīng)速度法）,在酶反應(yīng)過程中，連續(xù)記錄不同時(shí)間的底物消耗量或產(chǎn)物生成量。 酶底物大多是人工合成的“色素元”，其本身無色，經(jīng)酶作用后釋放出有色的反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)反應(yīng)過程中吸收度增高速率，算出酶活力單位。測定時(shí)間.例如：磷酸對硝基苯酚酯 對硝基苯酚法,,下文為中國藥典2015版胰蛋白酶活力測定方法，請仔細(xì)閱讀，并闡述此酶活力測定的

11、原理？其酶活力測定方法屬于哪一種？胰蛋白酶作用位點(diǎn)有哪些？寫出測定所用底物的英文縮寫？,供試品的制備：精密稱取本品適量，用鹽酸（0.001mol/L）制成每1ml中含50～60胰蛋白酶單位的溶液。底物溶液的制備：取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽85.7mg，加水溶解使成100ml，作為底物原液；底物溶液應(yīng)在制成后2小時(shí)內(nèi)使用。測定法：取底物溶液3.0ml，加鹽酸溶液（0.001ml/L）0.2ml，混勻，作為空白，取供試品溶液0.

12、2ml加底物溶液（預(yù)熱至25±0.5℃）3.0ml，立即計(jì)時(shí)并搖勻，使比色池內(nèi)溫度保持在25±0.5℃，照紫外－可見分光光度法在253nm的波長處，每隔30秒種讀取吸收度，共5分鐘。每30秒鐘吸收度的變化率應(yīng)恒定在0.015～0.018之間，呈線性關(guān)系的時(shí)間不得少于3分鐘。若不符合上述要求，應(yīng)調(diào)整供試品的溶液濃度，另行測定。以吸收度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)做圖，取在3分鐘內(nèi)成直線部分的吸收度，按下式計(jì)算。式中 P為

13、每1mg供試樣品中胰蛋白酶的單位數(shù)；A1為直線上終止的吸收度；A2為直線上開始的吸收度；T為A1至A2讀數(shù)的時(shí)間（分）；W為測定液中供試品的量；0.003為上述條件下，吸收度每分鐘改變0.003相當(dāng)于一個(gè)胰蛋白酶單位。,25,三、固定濃度法 （fixed-concentration essay）,根據(jù)酶催化反應(yīng)，使反應(yīng)產(chǎn)物達(dá)到額定的濃度時(shí)其反應(yīng)時(shí)間與酶濃度成反比的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)的。 [P]=

14、K[E]t以所需時(shí)間的倒數(shù)（1/t）對酶濃度作圖即可制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。優(yōu)點(diǎn)：1、記錄時(shí)間。2、準(zhǔn)確,26,第四節(jié) 酶活性測定方法的設(shè)計(jì),一、影響因素 二、底物與產(chǎn)物的測定方法 三、測定條件的選擇,27,一、影響因素,1、底物2、pH3、溫度4、酶濃度5、空白和對照,28,底物,酶可以同時(shí)作用多個(gè)底物。以Km最小者作為此酶的生理底物。從底物性質(zhì)看，選用的底物最好在物理化學(xué)性質(zhì)上與產(chǎn)物不同，利于測定。從底物濃度看，為不

15、使酶反應(yīng)受到它的控制，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)使用足夠高的底物濃度。,29,胰凝乳蛋白酶幾種底物的Km,30,底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響,31,pH,酶活力測定選用緩沖體系。不同緩沖液所受影響不同。磷酸鹽所受影響較小，而Tris則受影響較大。酶溶液用量與底物溶液比例不超過10％為宜。,32,溫度,溫度變化1 ℃，反應(yīng)速度可能相差10％以上，控制在± 0.1 ℃。反應(yīng)溫度一般為25 ℃，此時(shí)酶不易滅活，Km較小，可以使用較低的底物濃

16、度。有些酶在37 ℃不穩(wěn)定。,33,酶濃度,酶樣要充分稀釋。取3個(gè)不同酶量測得的產(chǎn)物量和酶濃度之間為正比關(guān)系，這樣的酶濃度范圍就是適當(dāng)?shù)摹?34,空白和對照,空白：指雜質(zhì)反應(yīng)或自發(fā)反應(yīng)引起的變化量，代表未知因素的影響。分為完全空白（如測定時(shí)要終止反應(yīng)，則空白可先加終止反應(yīng)試劑再加酶）。酶空白底物空白,35,二、底物與產(chǎn)物的測定方法 （酶反應(yīng)的檢測方法）,1、化學(xué)方法：用化學(xué)法測定其中某一底物或產(chǎn)物的變化值。2、分光光

17、度法： 常用的有比色法和紫外分光光度法。3、熒光測定法： 簡單、靈敏、快速。4、電化學(xué)分析法（1）    離子選擇性電極分析法（2）    微電流法5、其他方法如測定氣體的測壓法，測定產(chǎn)物旋光度變化值的旋光測定法。,酶活力測定反應(yīng)的檢測方法按照酶法分析方法測定酶活性時(shí)，需要跟蹤酶促反應(yīng)中某一反應(yīng)底物或產(chǎn)物的濃度隨時(shí)間發(fā)生的變化量（速度法），或測量酶促反應(yīng)中反應(yīng)產(chǎn)物

18、或底物濃度的總變化量（終點(diǎn)法）。可針對某些易于測定的酶促反應(yīng)底物或產(chǎn)物選擇具體的檢測方法，包括容量分析法、氣體檢測法、光學(xué)檢測法、黏度測定法、酶聯(lián)免疫法等。 分光光度法 若酶促反應(yīng)中，反應(yīng)底物或產(chǎn)物之一由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，其吸光度的強(qiáng)度發(fā)生變化，可以通過測定該酶促反應(yīng)系統(tǒng)的光吸收度的變化量，推算出酶的活力。多數(shù)酶類藥物的含量檢測（效價(jià)測定）均采用分光光度法，如胃蛋白酶、糜蛋白酶、門冬酰胺酶、溶菌酶等。,37,三、測定條件的

19、選擇,1、單因素選擇2、正交設(shè)計(jì)——多因素選擇,38,1、單因素選擇－比色法測溶菌酶活性,以染料艷紅K-2BP標(biāo)記的M·Lysodeikticus為底物，分解后產(chǎn)生游離染色碎片（產(chǎn)物）離心除去未分解底物，上清液比色吸收度為溶菌酶活力的函數(shù)。,39,測定條件選擇－S pH,（1）酶反應(yīng)底物濃度曲線以染料標(biāo)記的M·Lysodeikticus為底物，酶量為20μg時(shí)，1%底物濃度已接近使酶飽和。（2）

20、酶反應(yīng)PH曲線磷酸緩沖液和檸檬酸—磷酸緩沖液。不同組分的緩沖液，其最適PH稍有不同，選用pH6.5磷酸緩沖液。,,,40,測定條件選擇－離子強(qiáng)度 、反應(yīng)時(shí)間及[E],（3）離子強(qiáng)度對酶反應(yīng)的影響離子強(qiáng)度在0.3mol/L以上為宜，選用0.5mol/L。（4）酶反應(yīng)過程曲線(反應(yīng)時(shí)間)和酶濃度曲線酶量為20 μg時(shí)，反應(yīng)在30分鐘以內(nèi)，吸收度與反應(yīng)時(shí)間有良好的線性關(guān)系，測定系統(tǒng)選用15分鐘。酶量在50μg之內(nèi)，吸收度與酶濃度具

21、有線性關(guān)系。,,41,測定條件,1%染色菌體緩沖液1ml37℃水浴保溫約5分鐘加酶試樣0.5ml準(zhǔn)確反應(yīng)15分鐘加入酸/乳化劑混合液2ml，終止反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)離心，上清液于540nm比色，所得吸收度從酶濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查出試樣中溶菌酶含量。,42,二、正交設(shè)計(jì)－多因素選擇,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Orthogonal experimental design）是一種高效的利用正交表來安排多因素多水平設(shè)計(jì)試驗(yàn)的方法。通過巧妙的安排和分組，用

22、較少的試驗(yàn)次數(shù)，就能分析各因素的作用大小，找出最佳的試驗(yàn)條件。利用各因素所對應(yīng)指標(biāo)的極差R及平均極差D作出判斷。,43,正交試驗(yàn)優(yōu)選中性蛋白酶活力測定條件,中性蛋白酶是一種蛋白水解酶，活力測定以酪蛋白為底物，水解產(chǎn)物與福林試劑在堿性情況下反應(yīng)生成有色物質(zhì)，于680nm處測定吸收值。中性蛋白酶作用受緩沖液的pH值、底物濃度、反應(yīng)時(shí)間及酶濃度等因素的影響。供試品：0.01%的中性蛋白酶溶液。底物：酪蛋白,44,實(shí)驗(yàn)方案,實(shí)驗(yàn)取四個(gè)

23、因素： PH值、底物濃度、反應(yīng)時(shí)間、酶濃度。每個(gè)因素選三水平，屬于多因素多水平，為此選用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。,45,,46,正交試驗(yàn)表,,47,正交實(shí)驗(yàn)安排表,,48,正交實(shí)驗(yàn)安排表,49,各因素試驗(yàn)值計(jì)算結(jié)果,平均極差越大，對應(yīng)的因素影響越大。緩沖液PH值7.2，底物濃度0.5%，酶濃度用100U/ml為最佳反應(yīng)條件。反應(yīng)時(shí)間為10，20，30min，對OD值無顯著影響。,50,各因素試驗(yàn)值的方差分析,結(jié)論：PH值（

24、A）、底物濃度（B）、酶濃度（D）為非常顯著因子；反應(yīng)時(shí)間（C）為非顯著因子。,,51,第五節(jié) 酶類藥物的檢測,肽鍵水解酶 脂鍵水解酶 糖苷鍵水解酶 其它（超氧化物歧化酶）,52,一、肽鍵水解酶,1、胰蛋白酶2、彈性蛋白酶3、尿激酶,53,54,1、胰蛋白酶（Trypsin）,胰蛋白酶（Trypsin） ：由動(dòng)物胰臟中提取的一種蛋白水解酶。牛胰蛋白酶：223個(gè)氨基酸，分子量24000，等電點(diǎn)10.1。豬胰蛋白酶：21

25、4個(gè)氨基酸，分子量23400，等電點(diǎn)10.8。胰蛋白酶最適pH為7.6~8.0，電泳純的胰蛋白酶的比活為8000單位/mg。,55,胰蛋白酶,56,胰蛋白酶,57,原理,胰蛋白酶專一作用于賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的羧基組成的肽鍵、酰胺鍵及酯鍵，水解速度為酯鍵>酰胺鍵>肽鍵。BAEE(Benzoyl-L-Arginine-Ethyl-Ester)BAA(Benzoyl-L-Arginine-Anide)苯甲酰－L

26、－精氨酸乙酯（BAEE）在胰蛋白酶的作用下，酯鍵被水解生成苯甲酰－L－精氨酸，在253nm波長處的吸收度隨酶促反應(yīng)遞增，因此連續(xù)記錄不同時(shí)間的產(chǎn)物生產(chǎn)量，根據(jù)活力單位定義計(jì)算酶活力。,58,測定法：,取呈直線的吸收度，按下式計(jì)算：P為每mg供試品含胰蛋白酶的單位，U；A1為直線上終止的吸收度；A2為直線上開始的吸收度；T為A1至A2讀數(shù)的時(shí)間，min；W為測定液中供試品的量，mg；吸收度每分鐘改變0.003，即相當(dāng)于1個(gè)胰

27、蛋白酶單位 。,下文為中國藥典2015版胰蛋白酶活力測定方法，請仔細(xì)閱讀，并闡述此酶活力測定的原理？其酶活力測定方法屬于哪一種？胰蛋白酶作用位點(diǎn)有哪些？寫出測定所用底物的英文縮寫？,供試品的制備：精密稱取本品適量，用鹽酸（0.001mol/L）制成每1ml中含50～60胰蛋白酶單位的溶液。底物溶液的制備：取N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽85.7mg，加水溶解使成100ml，作為底物原液；底物溶液應(yīng)在制成后2小時(shí)內(nèi)使用。測定法：取底

28、物溶液3.0ml，加鹽酸溶液（0.001ml/L）0.2ml，混勻，作為空白，取供試品溶液0.2ml加底物溶液（預(yù)熱至25±0.5℃）3.0ml，立即計(jì)時(shí)并搖勻，使比色池內(nèi)溫度保持在25±0.5℃，照紫外－可見分光光度法在253nm的波長處，每隔30秒種讀取吸收度，共5分鐘。每30秒鐘吸收度的變化率應(yīng)恒定在0.015～0.018之間，呈線性關(guān)系的時(shí)間不得少于3分鐘。若不符合上述要求，應(yīng)調(diào)整供試品的溶液濃度，另行測定。

29、以吸收度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)做圖，取在3分鐘內(nèi)成直線部分的吸收度，按下式計(jì)算。式中 P為每1mg供試樣品中胰蛋白酶的單位數(shù)；A1為直線上終止的吸收度；A2為直線上開始的吸收度；T為A1至A2讀數(shù)的時(shí)間（分）；W為測定液中供試品的量；0.003為上述條件下，吸收度每分鐘改變0.003相當(dāng)于一個(gè)胰蛋白酶單位。,60,2、胰彈性蛋白酶（Elastase）,肽鍵水解酶，存在于哺乳動(dòng)物胰臟。胰彈性蛋白酶是由240個(gè)氨基酸組成的單

30、一肽鏈，有四對二硫鍵。分子量為25900，等電點(diǎn)為9.5。胰彈性蛋白酶除水解彈性蛋白外，還可以水解血紅蛋白、酪蛋白等蛋白。剛果紅－彈性蛋白。,61,胰彈性蛋白酶測定原理,剛果紅－彈性蛋白法：以剛果紅——彈性蛋白為底物，由于剛果紅——彈性蛋白結(jié)合的共價(jià)鍵能被彈性酶水解，根據(jù)剛果紅在495nm處有最大吸收，由標(biāo)準(zhǔn)曲線即可查得彈性酶單位數(shù)。單位：20分鐘水解1mg剛果紅－彈性蛋白所需的酶量為一個(gè)彈性酶活力單位。,62,方法:,,63

31、,3、尿激酶（Urokinase）,由人尿制得的一種堿性蛋白水解酶。主要作用是激活人體內(nèi)纖維蛋白溶酶原使其成為有活性的纖維蛋白溶酶，從而解聚血纖維蛋白，溶解血栓。天然尿激酶的分子量為54000，其作用于纖維蛋白溶解酶原的賴氨酸或精氨酸鍵使其裂解成纖維蛋白溶解酶。,64,效價(jià)測定原理(氣泡上升法),尿激酶激活人體內(nèi)纖維蛋白溶酶原使其轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶酶；纖維蛋白原在凝血酶的作用下，轉(zhuǎn)變成纖維蛋白凝塊，此凝塊在纖維蛋白溶酶作用下，水解

32、為可溶性小分子多肽。在纖維蛋白溶酶原過量的情況下，尿激酶量與纖維蛋白凝塊的溶解時(shí)間的對數(shù)成直線關(guān)系。,,,,,,,65,操作(氣泡上升法),試管中加纖維蛋白原溶液0.3ml（37℃水?。?biāo)準(zhǔn)品(或供試品) 1.0ml加混合溶液0.4ml立即搖勻計(jì)時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在30～45秒內(nèi)凝結(jié)，當(dāng)凝塊內(nèi)小氣泡上升到系統(tǒng)體積一半時(shí)作為反應(yīng)終點(diǎn)。以尿激酶的濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)時(shí)間的對數(shù)為縱坐標(biāo)。,,,,66,二、脂鍵水解酶－ 胰脂肪酶

33、(Pancreatic Lipase ),胰脂肪酶是一種水解酶，在一定條件下把甘油三脂類脂肪水解，最后生成甘油及脂肪酸。底物:橄欖油用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)堿溶液滴定，可定量地測定脂肪酸的量，從而得知脂肪酶活力。,67,測定,,68,計(jì)算,每分鐘水解橄欖油產(chǎn)生1μmol脂肪酸的酶量，為1個(gè)活力單位。每克含有的胰脂肪酶單位A:供試品消耗NaOH （0.1mol/L）的體積B:空白消耗NaOH （0.1mol/L）的體積W:供

34、試品取樣量（g）N:供試品稀釋倍數(shù)。,69,三、糖苷鍵水解酶 －溶菌酶,蛋清中提取的能分解粘多糖的堿性水解酶。溶菌酶（Lysozyme）具有抗菌、抗病毒等作用。溶菌酶分子量為14000～15000，由129個(gè)氨基酸殘基組成，等電點(diǎn)為10.0~11.1。溶菌酶屬糖苷鍵水解酶，能以某些細(xì)菌細(xì)胞中的多糖為底物。,70,溶菌酶作用位點(diǎn),71,青霉素,轉(zhuǎn)肽酶底物末端的二肽D-Ala-D-Ala結(jié)構(gòu),72,效價(jià)測定－比濁法,以溶酶小球

35、菌為底物，主要成分為粘多糖，粘多糖由NAG和NAM重復(fù)而成。只能水解NAM C1 和NAG C4之間的β－1，4糖苷鍵。溶酶小球菌胞壁中的粘多糖經(jīng)過溶菌酶的水解后，導(dǎo)致溶菌，溶液的吸收度下降。在一定的條件下，每分鐘吸收度下降0.001為一個(gè)酶活力單位。,73,比濁法測定,計(jì)算：酶活力單位（u/mg） =W為測試液中供試品的重量（μg）,74,比色法-測定溶菌酶活性,用染料艷紅K－2BP標(biāo)記的M.Lysodei

36、kticus為底物，酶催化細(xì)胞壁分解時(shí)游離出染色碎片（產(chǎn)物）反應(yīng)后離心除去未分解底物，上清液比色，吸收度為溶菌酶活力的函數(shù)。,75,溶菌酶效價(jià)測定－比色法,,76,四、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）,由動(dòng)物紅細(xì)胞制得的金屬酶，能催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化成過氧化氫和氧。來源于牛、豬、人紅血球的超氧化物歧化酶（SOD）含銅和鋅，分子量32000左右。SOD對熱較穩(wěn)定，在pH5.3~9.5范圍內(nèi)對酶活性影

37、響不大。牛紅細(xì)胞SOD PI為4.95。,77,效價(jià)測定,SOD測定方法：間接法：使用氧自由基指示清除劑， SOD與指示清除劑競爭O2- ，從而抑制指示清除劑與O2- 的結(jié)合，根據(jù)指示清除劑與O2- 反應(yīng)速度的變化可間接測定SOD的活性。間接法包括：黃嘌呤氧化酶－細(xì)胞色素C法和鄰苯三酚法。,78,黃嘌呤氧化酶－細(xì)胞色素C法,原理：在有氧條件下，黃嘌呤氧化酶能催化黃嘌呤成尿酸，與此同時(shí)產(chǎn)生O2- ，氧化型細(xì)胞色素C被O2- 還原為

38、還原型細(xì)胞色素C，后者在550nm有最大吸收，因此測定氧化性細(xì)胞色素C在加入SOD前后的光吸收變化可間接計(jì)算酶活性。,79,方法,,80,注意點(diǎn),在特定條件下，25 ℃（pH7.8）每分鐘抑制細(xì)胞色素C還原速率達(dá)50％所需要的酶量為一個(gè)活力單位。注意事項(xiàng)：重金屬離子易使黃嘌呤氧化酶失活，因此反應(yīng)體系中必須添加EDTA。反應(yīng)體系中含過氧化氫酶可引起還原型細(xì)胞色素C發(fā)生過氧化作用，從而干擾檢測的正確。,81,鄰苯三酚法,原理：在堿性

39、條件下，鄰苯三酚會發(fā)生自氧化生成紅 酚，同時(shí)生成O2- ，當(dāng)有SOD 存在時(shí)由于它能催化O2- 與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累。定義:在一定條件下，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50％的酶量為一個(gè)酶活力單位。,82,操作,定義:在一定條件下，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50％的酶量為一個(gè)酶活力單位。,83,門冬酰胺酶（L-Asparaginase）,本品系自大腸桿菌（E·coli ASI.35

40、7）中提取制備的具有酰氨基水解作用的酶。每毫克蛋白含門冬酰胺酶效價(jià)不得低于250U。抗腫瘤酶類藥物(腫瘤細(xì)胞缺乏L-門冬酰胺合成酶)。治療小兒急性淋巴細(xì)胞性白血病和淋巴肉瘤。,84,測定,在上述規(guī)定條件下，每分鐘催化L-門冬酰胺水解釋放1μg分子氨所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位比活力測定方法：采用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量，比活力=酶活力(U)/蛋白含量(mg)。,85,天冬氨酸酶活力的測定,,，一個(gè)酶活力單位定義為在測

41、定條件下，每小時(shí)每克細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成1µmol天冬氨酸所需的酶量.,86,實(shí)例：尿激酶（urokinase）,本品系從新鮮人尿中提取的一種激活纖維蛋白溶酶原的酶。由高分子量54000和低分子量33000組成的混合物，高分子量含量不得少于90%，每1mg蛋白中尿激酶活力不得少于12萬U，蛋白分解藥物。,87,尿激酶,（一）性狀本品為白色非結(jié)晶狀粉末（二）鑒別取比活力測定項(xiàng)下的供試品溶液，用巴比妥-氯化鈉緩沖液（pH7.8

42、）稀釋成每1ml中含20U的溶液，吸取1ml，加纖維蛋白原溶液0.3ml，再依次加入纖維蛋白溶酶原溶液0.2ml，凝血酶溶液0.2ml，迅速搖勻，立即置37±0.5℃恒溫水浴中保溫，記時(shí)，反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)在30～45s內(nèi)凝結(jié)，且凝塊在15min內(nèi)重新溶解。以0.9%氯化鈉溶液作空白，同法操作，凝塊在2h內(nèi)不溶。,88,（三）檢查,1．溶液的澄清度與顏色， 應(yīng)澄清無色。2．分子組分比 取本品，加水制成每1ml中含2mg的溶液后

43、，加入等體積的緩沖液，置水浴中3min，放冷，作為供試品溶液；取供試品溶液10μl，加至樣品孔，照電泳法測定，按下式計(jì)算高分子尿激酶相對含量（%）。,89,（三）檢查,3．干燥失重 取本品，以五氧化二磷為干燥劑，在60℃減壓干燥至恒重，減失重量不得過5.0%。 4．異常毒性取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml中含5000U的溶液，依法檢查，按靜脈注射法給藥，應(yīng)符合規(guī)定。5．熱原 取本品，加氯化鈉注射液制成每1ml中含20000

44、U的溶液，依法檢測，按家兔體重每1kg注射1ml，應(yīng)符合規(guī)定。,90,6. 凝血質(zhì)樣活性物質(zhì),（1）血漿的制備 。（2）復(fù)鈣試驗(yàn) 取小試管，加血漿0.1ml、6-氨基己酸溶液0.1ml及巴比妥緩沖液0.1ml，再加入氯化鈣溶液觀察凝固時(shí)間。以凝固時(shí)間最短的一管所加的氯化鈣量，為復(fù)鈣試驗(yàn)的氯化鈣溶液用量。（3）測定法 取小試管加入上述倍比稀釋的供試品溶液各0.1ml，再依次加入上述6-氨基己酸溶液和血漿各0.1ml，輕輕搖勻，在

45、25℃水浴中，靜置2～3min，迅速加入已預(yù)溫至25℃的復(fù)鈣試驗(yàn)所需的上述氯化鈣溶液用量，混勻，記錄放入時(shí)間。注意觀察血漿凝固，觀察時(shí)輕輕傾斜，避免影響凝血過程，記錄凝固時(shí)間?？瞻讓φ展苣虝r(shí)間減去供試品管凝固時(shí)間等于復(fù)鈣試驗(yàn)?zāi)炭s短時(shí)間。在單對數(shù)紙上，以供試品溶液的濃度為縱坐標(biāo)，以復(fù)鈣試驗(yàn)?zāi)炭s短時(shí)間（s）為橫坐標(biāo)，繪圖，連接不同稀釋度的供試品各點(diǎn)，應(yīng)成一直線，此直線外延至縱軸，與縱軸的交點(diǎn)即表示供試品濃度，也是凝血質(zhì)樣活性為零值

46、時(shí)的供試品酶活力，按每1ml中供試品的單位表示，每1ml應(yīng)大于150U。,91,（四）效價(jià)測定(氣泡上升法),原理：激活纖維蛋白溶酶原使其轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶酶，纖維蛋白溶酶具有較強(qiáng)的蛋白水解酶的能力。纖維蛋白原在凝血酶的作用下，轉(zhuǎn)變成纖維蛋白凝塊，此凝塊在纖維蛋白溶酶作用下，水解為可溶性小分子多肽。在纖維蛋白溶酶原過量的情況下，尿激酶量與纖維蛋白凝塊的溶解時(shí)間的對數(shù)成直線關(guān)系。,92,操作,,93,計(jì)算：,以尿激酶的濃度為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)

47、時(shí)間的對數(shù)為縱坐標(biāo)。注意：影響效價(jià)測定的主要因素是纖維蛋白溶酶原、凝血酶及纖維蛋白原，如發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率低于0.3，直線平坦，則纖維蛋白溶解酶原、凝血酶可能失活，需重新標(biāo)定或更換。效價(jià)測定過程中，各試劑需置37℃水浴中。,94,第三節(jié) 酶活力測定方法,固定時(shí)間法 連續(xù)監(jiān)測法 （一）、需NAD+或NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法： 直接測定法 偶聯(lián)法

48、 三聯(lián)酶活測定 （二）、不需NAD+或NADP+作指示的連續(xù)監(jiān)測法：固定濃度法,95,第四節(jié) 酶活性測定方法的設(shè)計(jì),一、影響因素 二、底物與產(chǎn)物的測定方法 三、測定條件的選擇 1、單因素選擇 2、正交設(shè)計(jì)——多因素選擇,96,第五節(jié) 酶類藥物的檢測,肽鍵水解酶 1、胰蛋白酶 2、彈性蛋白酶 3、尿激酶（氣泡上升法）脂鍵水解酶——胰脂肪酶