甾體激素類藥物的分析

1、第十章 甾體激素類藥物的分析 Analysis of steroid hormones,激素（Hormone，荷爾蒙） 是人體內(nèi)各種內(nèi)分泌腺所分泌的一種生物活性物質(zhì)。激素作用于特定的稱為靶器官的組織、細(xì)胞上而發(fā)揮作用。如果激素分泌出現(xiàn)平衡失調(diào)，可使人體發(fā)生病變，如甲亢、糖尿病等。,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,基本

2、結(jié)構(gòu),概 述,甾體激素類藥物均具有環(huán)戊烷駢多氫菲母核。,分類,甾體激素,腎上腺皮質(zhì)激素,性激素,雄性激素,孕激素,雌激素,,,蛋白同化激素,,,,（一）腎上腺皮質(zhì)激素,,,,△4–3–酮基（紫外吸收）,天然皮質(zhì)激素：氫化可的松,母核有21個碳原子,C17–醇酮基（還原性）,,醋酸地塞米松,,,,結(jié)構(gòu)修飾,,曲安息龍,,地塞米松磷酸鈉,,提高結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強抗炎作用,（二）雄性激素和蛋白同化激素,天然雄性激素：睪酮,,△4–3–

3、酮基,4位引入鹵素或19位去甲基或?qū)環(huán)結(jié)構(gòu)改造均明顯降低雄性作用，增加蛋白同化作用,母核有19個碳原子,A環(huán)中有△4–3–酮基結(jié)構(gòu),,,結(jié)構(gòu)修飾,增加脂溶性，制成油注射劑可口服、延效,丙酸睪酮,甲睪酮,增加位阻，難代謝氧化，穩(wěn)定性增強可口服,,,蛋白同化激素,苯丙酸諾龍,4-氯醋酸睪丸素,,,,,母核有18或19個碳原子,（三）孕激素,,,C17-?-甲酮基,△4–3–酮基,天然孕激素：黃體酮,母核有21個碳原子,口服被迅速破壞

4、失效，只能肌注,結(jié)構(gòu)修飾,醋酸甲地孕酮（孕酮類孕激素）,炔諾孕酮（睪酮類孕激素）,炔諾酮（睪酮類孕激素）,口服、長效,口服、長效，17-OH作成庚酸酯，注射一次可維持3個月,,,（四）雌激素,天然的雌性激素：雌二醇,母核有18個碳原子,A環(huán)為苯環(huán)，C3位上有酚羥基，C17位上有β-羥基,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，口服無效,,,結(jié)構(gòu)修飾,,,,炔雌醇,戊酸雌二醇,苯甲酸雌二醇,乙炔基引入，使仲醇變叔醇，增加空間位阻，阻礙酶對藥物的氧化代謝，可口服,17

5、位羥基酯化，酯在體內(nèi)緩慢水解，延效,3位羥基酯化，酯在體內(nèi)緩慢水解，延效,可口服高效長效,,,,人工合成代用品：非甾體化合物,己烯雌二酚,高效、長效,二、特殊官能團與分析方法,第二節(jié) 鑒別試驗,一、物理常數(shù)的測定,二、化學(xué)鑒別法,三、制備衍生物測定熔點,四、紫外分光光度法五、紅外分光光度六、薄層色譜法七、高效液相色譜法,第二節(jié) 鑒別試驗,二、化學(xué)鑒別法（一）呈色反應(yīng),（1）與強酸的呈色反應(yīng),強酸： H2SO4、H3P

6、O4、HClO4、HCl,原理：酮基先質(zhì)子化，形成正碳離子，再與HSO4-作用呈色。,與硫酸顯色反應(yīng),1、C3–酮基和C20–酮基,（1）與羰基試劑2,4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼反應(yīng)生成腙。,(2)官能團的呈色反應(yīng),（2）與羥胺或氨基脲分別生成具有一定熔點的肟或縮氨脲。,+,,,HCl,黃色,3，20-雙腙,室溫下長時間加熱,,,,結(jié)論：,成腙反應(yīng)中,C20–酮基受C18甲基的空間位阻影響，反應(yīng)較慢，需加熱或較長時間放置，才完成反

7、應(yīng)。,C11–酮基受C18、C19位甲基甲基的阻礙，不發(fā)生反應(yīng)。,C3–酮基空間位阻最小，最易起反應(yīng)，室溫下先生成單腙。,,,2、C17–α–醇酮基的呈色反應(yīng)（還原性）,能與堿性酒石酸銅試液（斐林試液）、氨制AgNO3試液（多倫試液）、四氮唑鹽反應(yīng)呈色。其中以四氮唑鹽的顯色反應(yīng)最為常用，不但可用作層析法的顯色劑，還可用于含量測定.,適用：腎上腺皮質(zhì)激素。,＋ 2Cu2+ + 4OH-,+ Cu2O + H2O,橙紅色,,,＋ 2A

8、g+ + 2OH-,,,+2Ag + CH3COOH,黑色,醋酸去氧皮質(zhì)酮,,,+,,H2O,+ CH3COOH,+,+,OH-,醋酸潑尼松,深紅色的三苯甲鐕,四氮唑鹽,結(jié)論：,三苯甲鐕于490nm處顯示最大吸收，可用比色法測含量。,四氮唑鹽反應(yīng)還用于腎上腺皮質(zhì)激素類藥物中雜質(zhì)“有關(guān)物質(zhì)”檢查的顯色劑。,反應(yīng)在堿性條件下（水解）進(jìn)行。,適用：具有甲酮基或活潑亞甲基的甾體激素類藥物。,3.甲酮基的呈色反應(yīng),能與亞硝基鐵氰化鈉、間二硝基

9、酚、芳香醛反應(yīng)呈色。,孕激素,（1）甲酮基：,黃體酮專屬性反應(yīng)。,黃體酮,其他甾體,亞硝基鐵氰化鈉,,,,藍(lán)紫色,淡橙色或不顯色,結(jié)論：,在堿性條件下進(jìn)行。,與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)稱為堿性硝普鈉反應(yīng)。,（2）亞甲基的反應(yīng)：,硫酸普拉睪酮,乙醇間二硝基苯,氫氧化鈉,紫紅色,,,適用：雌激素類藥物。,4.酚羥基的呈色反應(yīng),能與重氮苯磺酸發(fā)生偶合反應(yīng)，生成紅色偶氮染料。,苯甲酸雌二醇,H+,+,,紅色,有機氟,Fˉ,,有機破壞,有機氯,,,5

10、、鹵元素的呈色反應(yīng),,茜素氟藍(lán)—硝酸亞鈰,硝酸—硝酸銀,,呈藍(lán)紫色,Clˉ,,AgCl,氯原子結(jié)合在母核環(huán)上,6、沉淀反應(yīng),（1）與堿性酒石酸銅（斐林試液）的沉淀反應(yīng),（2）氨制AgNO3（多倫試液）的沉淀反應(yīng),（3）與AgNO3的沉淀反應(yīng),適用：含炔基的甾體激素類藥物（炔雌醇、炔諾酮）。,機理：,↓,HNO3,+,,+,,NaOH滴定，電位法指示終點,（4）與HNO3-AgNO3的沉淀反應(yīng),適用：甾體激素類藥物C21位上有氯原子取代，

11、如丙酸氯倍他索。,機理：,有機氯原子,,水解加熱,無機氯原子,結(jié)合在母核環(huán)上的氯原子,氧瓶燃燒法 破壞,無機氯原子,,,硝酸—硝酸銀,,AgCl,,原理：一些甾體激素類藥物具有醋酸酯、戊酸酯及已酸酯的結(jié)構(gòu)，可先行水解，根據(jù)水解產(chǎn)物來鑒別。,7、水解產(chǎn)物的反應(yīng),適用： 本類藥物C3、C17或C21位上羥基的酯,結(jié)果： 醋酸酯水解后生成的醋酸可與乙醇反應(yīng)，生成有香氣醋酸乙酯。,戊酸或己酸酯類水解后可生成有特臭的戊酸或己酸，進(jìn)

12、行鑒別。,三、制備衍生物測熔點,（二）酯的水解,醇制KOH 水解,m.p.為150℃~ 156℃,,（一）酯的生成,+ KOH,,丙酸睪丸素,睪丸素,m.p.為201℃,+,,,m.p.約182℃（分解）,（三）縮氨基脲的生成,苯丙酸諾龍,苯丙酸諾龍縮氨脲,H2NCONHNH2,（四）酮肟的生成,炔諾酮,,HONH2,炔諾酮肟,m.p.約195℃（分解）,,醋酸潑尼松,,△４-3-酮,（五）UV-ViS分光光度法,240nm左右,2

13、80nm左右,苯環(huán),其他共軛結(jié)構(gòu),原 理,200-760nm有特征吸收。,方 法,可規(guī)定最大吸收波長、A、吸收系數(shù)、A大/A小。,,,,,,示 例,結(jié)構(gòu)特征： 酚羥基 C17 –OH C17 –乙炔基,eg1:炔雌醇,（六）IR法,,原料藥,1505cm-1,3505cm-1,3300cm-1,ν,1590cm-1,3610cm-1,酚羥基,醇羥基,1615cm-1,苯環(huán)的骨架振動,eg2：黃體酮,△４-3-酮,結(jié)構(gòu)特

14、征：,C17-酮基,1700cm-1,?C=O,20位酮基,1665cm-1,3位酮基,1615cm-1,870cm-1,?C-H,雙鍵,,第三節(jié) 特殊雜質(zhì)檢查,雜質(zhì)來源：原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物以及試劑和溶劑。,一、有關(guān)物質(zhì)的檢查,其他甾體：有些雜質(zhì)與該甾體激素藥物結(jié)構(gòu)類似，也具有一定的藥理作用而又互不相同，因此在甾體激素類藥物的質(zhì)量控制中，“其他甾體”的限度檢查顯得很重要。,檢查方法：（具有一定分離能力）,判定方法：規(guī)定雜質(zhì)

15、斑點數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)斑點顏色,1、TLC法（自身對照法）,eg：氫化可的松中其他甾體的檢查 供試液：本品+氯仿-甲醇（9：1） 濃度：3.0mg/ml 對照液：供試液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1） 60μg/ml 層析：供試液 對照液 點樣、展開、斑點檢出。 判斷：供試液如顯雜質(zhì)斑點，不得多于3個，其顏色與對照液的主斑點比較，不得更深。,2

16、、HPLC法（自身對照法）,≤圖A中峰1面積的四分之三,,判定方法： 規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目 規(guī)定雜質(zhì)峰面積,二、游離磷酸鹽的檢查,方法：對照品比色法,,雜質(zhì)來源：地塞米松磷酸鈉生產(chǎn)過程中，由磷酸酯化時殘存的過量磷酸鹽。,結(jié)果判斷：供試品溶液的吸光度不得大于對照溶液的吸光度。,740nm,原理：供試液+鉬酸銨+1-氨基-2-萘酚-4-磺酸 鉬藍(lán),三、有機溶劑殘留量的檢查,eg：地塞米松磷酸鈉,方法：GC色譜法,

17、雜質(zhì)來源：地塞米松磷酸鈉生產(chǎn)中，使用大量甲醇和丙酮。,結(jié)果判斷：不得出現(xiàn)甲醇峰，甲醇含量≤0.3％ 丙酮規(guī)定不得過≤5.0%,四、硒的檢查,,氧瓶燃燒,二氨基萘比色法測定,雜質(zhì)來源：地塞米松、氟輕松和曲安奈得等甾體激素類藥物，在生產(chǎn)中使用二氧化硒(SeO2)脫氫工藝，藥物可能引入雜質(zhì)硒。,方法：藥物,結(jié)果判斷：供試品溶液的吸光度不得大于硒對照溶液的吸光度（0.005％～0.01％） 。,378nm,五、雌酮,六

18、、乙炔基,第四節(jié) 含量測定,常用方法,容量法,比色法,紫外分光光度法,熒光法,氣相色譜法,高效液相色譜,,四氮唑鹽比色法,異煙肼比色法,鐵-酚試劑比色法,,USP、BP、JP均采用,方法：RP－HPLC（內(nèi)標(biāo)法）,測定對象：甾體激素類藥物的原料和制劑。,eg：黃體酮的含量測定色譜條件：固定相 ODS，檢測波長254nm 流動相 甲醇-水（65:35） 內(nèi)標(biāo)物 己烯雌酚系統(tǒng)適用性試驗

19、：n>1000，R符合規(guī)定。,測定樣品：黃體酮原料、注射液。定量方法：內(nèi)標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)-1,,,,二、UV-ViS分光光度法,1、△４-3-酮 240nm（±）,2、苯環(huán) 280nm（±） 雌激素,腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素,（一）UV分光光度法,缺點：專屬性不強,示例：醋酸地塞米松片的含量均勻度檢查（1）配制供試液，取10片分別進(jìn)行測定（2）測定：240nm（3）計算,,（二）

20、 比色法,,1、 四氮唑鹽比色法,（1）原理：腎上腺皮質(zhì)激素類C17-α－醇酮基強還原性。,,[H],三苯甲瓚↓深紅,,藍(lán)四氮唑（BT）525 nm,（2）方法：對照品法,（3）影響因素,A. 基團對反應(yīng)速度的影響,C11= O＞C11－OH,C21－OH未酯化＞C21-OH酯化,B、溶劑和水分的影響,以無水乙醇為溶劑，水含量大時，呈色減慢，不超過5％對結(jié)果沒有影響。,C、O2與光線的影響,避光、隔絕空氣、快速、充N2,D、堿的種類及

21、加入順序,以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳,加入順序：皮質(zhì)激素溶液,四氮唑鹽,堿試液,,,E. 溫度與時間,室溫（25℃）反應(yīng)40～45 min,F. 干擾物的影響,油膏、冷霜等制劑含聚乙二醇、丙二醇、羊毛脂對BT的顯色反應(yīng)有干擾，要先分離后測定。,（1） 原理,異煙腙（黃）,HCl,,420nm,2、異煙肼比色法,C3-酮基+異煙肼,H2O,腎上腺皮質(zhì)激素 雄性激素蛋白同化激素孕激素,,,（2）方法：對照品法,（3）影響因素,A.反應(yīng)

22、速度（反應(yīng)專屬性）,C3=O＞C17= O 、C20= O C11= O 不反應(yīng),B. 溶劑的選擇,異煙肼鹽酸鹽→受溶解度的影響,無水甲醇無水乙醇,,對試劑的穩(wěn)定性好呈色強度較無水乙醇中高對植物油的溶解度小,C.水分、溫度、O2與光線的影響,含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓,O2與光線對反應(yīng)的影響不大,t℃ ↑ → ν↑,D.酸的種類和濃度及異煙肼的濃度,酸:異煙肼 = 2:1,鹽酸濃度0.0074mol/L,最大A,,異煙肼濃度

23、0.00365mol/L,（1）原理,λmax=515,,,雌二醇-3-甲醚,,λmax=465,λmax=515,,,,[(NH4)2Fe(SO4)2 + H2SO4 + H2O2 + 苯酚],鐵－酚試劑 Iron-phenol Reagent,鐵鹽的作用 加快黃色產(chǎn)物的形成、轉(zhuǎn)化 加強紅色產(chǎn)物的穩(wěn)定性,酚的作用 加快紅色產(chǎn)物的形成 消除反應(yīng)產(chǎn)生的熒光,練習(xí)與思考,[A型題],1. 醋酸地塞

24、米松的鑒別方法是A.三氯化鐵反應(yīng) B.水解反應(yīng) C.柯柏反應(yīng) D.與堿性酒石酸銅試液反應(yīng)E.雙縮脲反應(yīng),[B型題],A.亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng) B.Vitali反應(yīng) C.Kedde反應(yīng) D.綠奎寧(thalleiaqllin)反應(yīng) E.堿試酒石酸銅試液的反應(yīng) 1. 黃體酮 2. 醋酸地塞米松 3. 地高辛 4. 硫酸奎寧,A,E,C,D,簡答題：1、簡述異煙