核酸類(lèi)藥物分析

1、核酸類(lèi)藥物分析,第一節(jié) 概 述第二節(jié)　分析方法第三節(jié)　應(yīng)用實(shí)例,第一節(jié) 概 述,一、結(jié)構(gòu)與分類(lèi)核酸類(lèi)藥物可以通過(guò)幫助恢復(fù)正常代謝或干擾某些異常代謝來(lái)達(dá)到治療疾病的目的。核酸是由多個(gè)單核苷酸通過(guò)３′，５′磷酸二酯鍵聚合而成的生物大分子，單核苷酸的基本結(jié)構(gòu)包括核苷和磷酸，核苷是含氮堿基（嘌呤堿與嘧啶堿） 與戊糖通過(guò)糖苷鍵縮合而成。根據(jù)戊糖的種類(lèi)可將核酸分為核糖核酸和脫氧核糖核酸。,核酸、核苷酸類(lèi)藥物是指具有藥用價(jià)

2、值的核酸、核苷酸、核苷和堿基以及它們的類(lèi)似物或衍生物。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成可分成四類(lèi)：①核酸堿基及其衍生物，如硫鳥(niǎo)嘌呤、氟尿嘧啶、阿昔洛韋等；②核苷及其衍生物，如肌苷、利巴韋林、阿糖胞苷；③核苷酸及其衍生物，如三磷酸腺苷二鈉、胞磷膽堿鈉、環(huán)磷腺苷；④多核苷酸，如寡聚核苷酸、核糖核酸Ⅰ、核糖核酸Ⅱ、抗腫瘤免疫核糖核酸等。,阿昔洛韋其化學(xué)名為9-(2-羥乙氧甲基）鳥(niǎo)嘌呤?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)式：藥理作用：　　抗病毒藥。體外對(duì)單純性皰疹病

3、毒、水痘帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒等具抑制作用。　?、俑蓴_病毒DNA多聚酶，抑制病毒的復(fù)制；　?、谠贒NA多聚酶作用下，與增長(zhǎng)的DNA鏈結(jié)合，引起DNA鏈的延伸中斷。本品對(duì)病毒有特殊的親和力，但對(duì)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞毒性低。,二、理化性質(zhì)１溶解性 多核苷酸、核苷酸類(lèi)藥物均為磷酸鹽，除環(huán)磷腺苷外，在水中均易溶。   核苷類(lèi)藥物在乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑中的溶解度均較差，部分核苷類(lèi)藥物在水中

4、易溶（如利巴韋林），部分核苷類(lèi)藥物在水中微溶（如肌苷）。核酸堿基類(lèi)藥物大多能溶于酸性或堿性溶劑，如氟胞嘧啶，在稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液中易溶。,２紫外吸收　 核苷酸的磷酸酯和戊糖均沒(méi)有明顯的紫外吸收，而嘌呤堿和嘧啶堿等堿基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，在紫外光區(qū)有明顯吸收。因此多核苷酸、核苷酸和核苷與構(gòu)成它們的堿基具有相似的紫外吸收光譜，最大吸收波長(zhǎng)一般在２６０ｎｍ附近。３酸堿性　 核苷酸分子結(jié)構(gòu)中的

5、磷酸和戊糖均呈酸性，其中磷酸酸性較強(qiáng)，堿基為含氮化合物呈弱堿性，故多核苷酸、核苷酸類(lèi)和核苷類(lèi)藥物均為兩性化合物。核酸堿基類(lèi)藥物只有堿基，呈堿性。４水解性　 核苷酸類(lèi)藥物分子結(jié)構(gòu)中磷酸與戊糖間的酯鍵和戊糖與堿基間的糖苷鍵都會(huì)發(fā)生水解，同樣條件下酯鍵先水解。,第二節(jié)　分析方法,各種核酸類(lèi)藥物都含有堿基，都具有弱堿性和紫外吸收性質(zhì)； 多核苷酸、核苷酸、核苷類(lèi)藥物中均含有戊糖； 多核苷酸和核苷酸結(jié)構(gòu)

6、中都含有磷酸。 因此它們有一些共同的分析方法，如用紫外分光光度法進(jìn)行鑒別或含量測(cè)定。,一、鑒別（一）化學(xué)鑒別１戊糖的鑒別（１）地衣酚反應(yīng)　核糖核酸、核糖核苷酸或核糖核苷與酸共熱時(shí)，水解形成的戊糖基脫水變?yōu)榭啡?，再與３，５二羥基甲苯（地衣酚） 反應(yīng)，縮合生成綠色化合物。用三價(jià)鐵鹽或銅鹽作催化劑，可增加呈色的靈敏度。地衣酚反應(yīng)特異性較差，凡戊糖均有此反應(yīng)。,綠色 670nm,,（２）二苯胺反應(yīng)

7、 脫氧核糖核酸、脫氧核苷酸或脫氧核苷與酸共熱水解產(chǎn)生的脫氧核糖在乙醛存在下與二苯胺反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，在５９５ｎｍ波長(zhǎng)處有最大吸收。 核糖核酸、核糖核苷酸無(wú)此反應(yīng)。,藍(lán)色 595nm,２磷酸鹽的鑒別　 核酸、核苷酸類(lèi)藥物在酸性條件下加熱水解產(chǎn)生的磷酸與過(guò)量的鉬酸銨［（ＮＨ４）３ＭｏＯ４］反應(yīng)，生成磷鉬酸銨放冷析出黃色沉淀。此反應(yīng)為磷酸鹽的一般鑒別試驗(yàn)。 ３嘌呤堿的鑒別　含有

8、嘌呤堿的核酸類(lèi)藥物在水溶液中可與氨制硝酸銀試液反應(yīng)，生成白色的銀鹽，遇光變?yōu)榧t棕色。此反應(yīng)為嘌呤堿的特征鑒別反應(yīng)。,４氟元素的鑒別　 氟尿嘧啶、氟胞嘧啶等含氟有機(jī)化合物遇強(qiáng)氧化劑如三氧化鉻的飽和硫酸溶液時(shí)，在微熱條件下會(huì)產(chǎn)生氟化氫，腐蝕玻璃表面造成硫酸溶液不能均勻涂于管壁，產(chǎn)生類(lèi)似油垢的現(xiàn)象。 ５硫元素的鑒別　 硫鳥(niǎo)嘌呤分子結(jié)構(gòu)中的Ｓ元素在甲醇鈉溶液中緩緩加熱后會(huì)轉(zhuǎn)化成硫化氫氣體，使醋酸鉛試紙顯黑色

9、或灰色。巰嘌呤分子結(jié)構(gòu)中的巰基還可與醋酸鉛試液反應(yīng)生成黃色沉淀。,（二）光譜鑒別１. 紫外吸收光譜法　 堿基結(jié)構(gòu)中的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)在紫外光區(qū)具有特征吸收，可用于鑒別。 如吸收系數(shù)、最大吸收波長(zhǎng)及其固定濃度下的吸光度、最小吸收波長(zhǎng)等。,２紅外吸收光譜法　 紅外吸收光譜法主要分為標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照法或?qū)φ掌穼?duì)照法，《中國(guó)藥典》主要采用標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)照法。 紅外光譜具

10、有疊加性，共存組分會(huì)使待測(cè)組分的紅外光譜圖發(fā)生變化，因此紅外吸收光譜法一般用于純度較高的原料藥的鑒別。 影響紅外吸收光譜的因素較多: 如試樣的制備方法、水分、晶型等，因此鑒別時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定繪制圖譜。對(duì)于可能發(fā)生轉(zhuǎn)晶的藥物，需按規(guī)定重結(jié)晶后再繪制圖譜，如更昔洛韋的鑒別，本品的紅外光吸收?qǐng)D譜應(yīng)與對(duì)照品的圖譜一致，如不一致，取本品和對(duì)照品適量，分別加水制成飽和溶液，濾過(guò)，取濾液在１０℃以下放置過(guò)夜，待析出結(jié)

11、晶，濾過(guò)，濾渣經(jīng)１０５℃干燥后，再次測(cè)定。,二、檢查 核糖核酸、脫氧核苷酸鈉多采用提取法制備，寡聚核苷酸多采用化學(xué)合成法，核酸堿基、核苷、核苷酸類(lèi)藥物大多采用酶解法、發(fā)酵法和半合成法制備。 核酸類(lèi)藥物的雜質(zhì)檢查包括一般雜質(zhì)檢查、特殊雜質(zhì)檢查和安全性檢查。 一般雜質(zhì)檢查主要有氯化物、硫酸鹽、重金屬、砷鹽、銨鹽、鐵鹽、干燥失重、熾灼殘?jiān)?，安全性檢查主要有細(xì)菌內(nèi)毒素

12、、異常毒性、無(wú)菌檢查等，重點(diǎn)介紹從原料中帶入或在生產(chǎn)過(guò)程中引入的雜質(zhì)、污染物或其他成分等特殊雜質(zhì)。,（一）多核苷酸類(lèi)藥物的檢查１吸光度 核糖核酸、脫氧核苷酸鈉多采用提取法從細(xì)胞或動(dòng)物內(nèi)臟制得，如核糖核酸Ⅰ系由健康豬的肝臟提取制得。制備過(guò)程中不可避免會(huì)帶入一定的蛋白質(zhì)，吸光度檢查即為了控制核酸類(lèi)藥物中蛋白質(zhì)的含量。具體方法是配制一定濃度的供試液，分別在２６０ｎｍ與２８０ｎｍ的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，要求該吸光度比

13、值應(yīng)不得低于１.７。 純ＲＮＡ在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ波長(zhǎng)處的吸光度比值在２.０以上，ＤＮＡ的吸光度比值為１.９左右；當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量增加時(shí)該比值會(huì)下降。,,２核糖核酸中脫氧核糖核酸的檢查　 檢查原理:脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性條件下與二苯胺反應(yīng)會(huì)生成藍(lán)色化合物，在６００ｎｍ附近有最大吸收，而核糖核酸無(wú)此反應(yīng)。通過(guò)控制６００ｎｍ處的吸光度，即可控制脫氧核糖核酸的含量。,,３增色效應(yīng)

14、 核酸分子解鏈變性或斷鏈時(shí)，其發(fā)色基團(tuán)———堿基暴露后，會(huì)造成紫外吸收增強(qiáng)的現(xiàn)象。但其他的雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)也具有增色效應(yīng)，故通過(guò)要求增色效應(yīng)不得低于某個(gè)數(shù)值，可以控制相關(guān)雜質(zhì)。如核糖核酸Ⅰ要求本品的增色效應(yīng)大于３０％.,（二）核苷酸、核苷、核酸堿基類(lèi)藥物的檢查１有關(guān)物質(zhì)　結(jié)構(gòu)相似的其他非目標(biāo)化合物，即有關(guān)物質(zhì)。以硫鳥(niǎo)嘌呤中“有關(guān)物質(zhì)”檢查為例進(jìn)行說(shuō)明。硫鳥(niǎo)嘌呤是以鳥(niǎo)嘌呤為原料制備而得，終產(chǎn)品中可能帶入殘留的原料、

15、中間體、副反應(yīng)產(chǎn)物等結(jié)構(gòu)與硫鳥(niǎo)嘌呤類(lèi)似的雜質(zhì)，統(tǒng)稱(chēng)為“有關(guān)物質(zhì)”。該類(lèi)雜質(zhì)中，鳥(niǎo)嘌呤是已知雜質(zhì)且有對(duì)照品，采用對(duì)照品對(duì)照法進(jìn)行檢查；其他雜質(zhì)則采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法進(jìn)行檢查。,２含氯量　鹽酸阿糖胞苷的生產(chǎn)過(guò)程中可能會(huì)因成鹽不完全或產(chǎn)生一些其他的鹽酸鹽雜質(zhì)，造成藥物中鹽酸的含量發(fā)生變化，即氯含量發(fā)生變化。因此通過(guò)含氯量測(cè)定可控制其純度。３含氟量　氟尿嘧啶原料藥中氟化程度也可通過(guò)含氟量來(lái)進(jìn)行控制。,三、含量測(cè)定

16、 核酸類(lèi)藥物結(jié)構(gòu)中的嘧啶堿和嘌呤堿，具有一定的弱堿性，可采用非水堿量法進(jìn)行含量測(cè)定； 其共軛結(jié)構(gòu)具有一定的紫外吸收，可通過(guò)測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)的吸光度來(lái)測(cè)定含量，也可用帶紫外檢測(cè)器的ＨＰＬＣ法定量。 核酸類(lèi)原料藥的雜質(zhì)較少時(shí)，可用非水堿量法或紫外分光光度法定量；雜質(zhì)較多時(shí)則需采用具有分離、分析能力的高效液相色譜法。,（一）非水堿量法１原理　

17、 核苷或堿基衍生物、類(lèi)似物等藥物的堿性較弱，在水溶液中用酸滴定時(shí)沒(méi)有明顯的突躍，難以獲得滿意的測(cè)定結(jié)果。而在冰醋酸溶劑中，弱堿性基團(tuán)的相對(duì)堿強(qiáng)度得到顯著增加，可被高氯酸滴定液定量滴定，根據(jù)消耗的高氯酸滴定液體積即可計(jì)算該類(lèi)藥物的含量。 以更昔洛韋的含量測(cè)定為例：取本品約０.１５ｇ，精密稱(chēng)定，加冰醋酸４０ｍｌ，加熱使溶解，放冷，加結(jié)晶紫指示液１滴，用高氯酸滴定液（０.１ｍｏｌ／Ｌ）滴定至溶液顯綠色，并將滴定

18、結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每１ｍｌ的高氯酸滴定液（０.１ｍｏｌ／Ｌ）相當(dāng)于２５.５２ｍｇ的Ｃ９Ｈ１３Ｎ５Ｏ４。,２注意事項(xiàng)　 該方法準(zhǔn)確度高、精密度好，在具弱堿性原料藥的含量測(cè)定中應(yīng)用廣泛。但該方法受到的影響因素較多，必須注意以下問(wèn)題。（１）水分在冰醋酸中呈堿性，可與高氯酸反應(yīng)，所以反應(yīng)體系中不應(yīng)有水分。（２）由于所用溶劑———冰醋酸有揮發(fā)性且膨脹系數(shù)較大，高氯酸滴定液的濃度受溫度和貯存條件影響很大。滴定時(shí)與標(biāo)定時(shí)

19、的溫度差對(duì)高氯酸滴定液濃度的影響很大，一般溫度差小于１０℃時(shí)，滴定液的濃度經(jīng)校正后即可用于定量計(jì)算；若溫度差超過(guò)１０℃，則應(yīng)重新標(biāo)定滴定液的濃度。高氯酸滴定液的濃度校正公式如下：,,（３）冰醋酸溶劑的揮發(fā)、弱堿性雜質(zhì)的存在都可能對(duì)測(cè)定結(jié)果造成干擾，故該法必須進(jìn)行空白校正，即不加供試品，同法操作，所得結(jié)果應(yīng)扣除空白。（４）常用電位滴定法和指示劑法作為終點(diǎn)的指示方法，但指示劑的終點(diǎn)顏色變化需用電位滴定法確定。,（二）紫外分光光

20、度法 嘌呤堿基和嘧啶堿基的紫外吸收特征除了可用于鑒別外，還可用于該類(lèi)藥物的含量測(cè)定。 《中國(guó)藥典》（２０１５年版） 收載的巰嘌呤、氟尿嘧啶和別嘌醇的原料藥均采用紫外分光光度法中的吸收系數(shù)法進(jìn)行含量測(cè)定。（三）高效液相色譜法 大多數(shù)核酸類(lèi)藥物可用常規(guī)的反相高效液相色譜法進(jìn)行分離測(cè)定，但部分結(jié)構(gòu)中存在極性基團(tuán)的核酸類(lèi)藥物采用常規(guī)方法分離時(shí)，效果較差，需改用一些

21、特殊的高效液相色譜法，如離子對(duì)色譜法或離子交換色譜法。,１離子對(duì)色譜法　 核苷酸類(lèi)藥物的磷酸基在反相高效液相色譜條件下經(jīng)常以離子化狀態(tài)存在，保留很弱，不利于分離和測(cè)定。 離子對(duì)高效液相色譜法可以有效改善核苷酸的色譜保留，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。 《中國(guó)藥典》（２０１５年版） 收載的環(huán)磷腺苷、三磷酸腺苷二鈉和胞磷膽堿鈉均采用離子對(duì)色譜法進(jìn)行含量測(cè)定。 離

22、子對(duì)色譜法是在流動(dòng)相中加入適量的反離子，使其與呈解離狀態(tài)的待測(cè)組分形成離子對(duì)，增加其在非極性固定相上的分配，從而改善其色譜保留與分離行為。 核苷酸為酸性物質(zhì)，故其離子對(duì)試劑常用季銨鹽陽(yáng)離子試劑，如四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨。離子對(duì)色譜的影響因素較多，包括反離子的性質(zhì)和濃度、流動(dòng)相的組成、ｐＨ值和離子強(qiáng)度等，需仔細(xì)選擇。,環(huán)磷腺苷的含量測(cè)定: 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)　用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以

23、磷酸二氫鉀與四丁基溴化銨的混合溶液 為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為２５８ｎｍ。 取環(huán)磷腺苷對(duì)照品約１０ｍｇ，加水５ｍｌ使溶解，加１ｍｏｌ／Ｌ的鹽酸溶液１ｍｌ，水浴加熱３０ｍｉｎ后冷卻，用氫氧化鈉試液調(diào)至中性，用水稀釋制成每１ｍｌ中約含０.２ｍｇ 的溶液，取２０μｌ注入液相色譜儀，環(huán)磷腺苷峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求，理論板數(shù)按環(huán)磷腺苷峰計(jì)算不得低于２０００，拖尾因子應(yīng)小于１.４。,２離子交換色譜法 核酸類(lèi)藥物

24、結(jié)構(gòu)中有含氮堿性基團(tuán)、多羥基糖苷，有些還以磷酸鹽形式存在，這些基團(tuán)會(huì)與常規(guī)的Ｃ１８色譜柱上的殘留硅醇羥基發(fā)生氫鍵吸附，造成峰形拖尾和柱壓升高，不利于分離測(cè)定。利用該類(lèi)藥物在適當(dāng)條件下可發(fā)生離子化的性質(zhì)，改用離子交換樹(shù)脂（如磺化交聯(lián)的苯乙烯－二乙烯基共聚物） 作為固定相填料，通過(guò)離子交換原理進(jìn)行分離，可以有效改善拖尾的問(wèn)題。 《中國(guó)藥典》從２００５年版開(kāi)始改用陽(yáng)離子交換色譜法對(duì)利巴韋林進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果有

25、明顯改善。,利巴韋林的含量測(cè)定。 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)　用磺化交聯(lián)的苯乙烯－二乙烯基共聚物的氫型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂為填充劑；以水（用稀硫酸調(diào)節(jié)ｐＨ值至２.５±０.１） 為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為２０７ｎｍ。理論板數(shù)按利巴韋林峰計(jì)算不低于２０００。離子交換色譜常使用水緩沖溶液作流動(dòng)相，有時(shí)也通過(guò)加入適量有機(jī)溶劑如甲醇或乙醇來(lái)提高分離度或改善樣品的溶解度。,第三節(jié)　應(yīng)用實(shí)例,一、巰嘌呤 巰嘌呤

26、為次黃嘌呤類(lèi)似物，通過(guò)抑制核酸合成而發(fā)揮抗腫瘤作用。藥用為含一個(gè)結(jié)晶水的巰嘌呤。本品主要經(jīng)化學(xué)合成法制備。 巰嘌呤主要以氰乙酸乙酯為原料進(jìn)行合成。在加熱的無(wú)水乙醇與乙醇鈉溶液中，氰乙酸乙酯先與硫脲環(huán)合生成２－巰基－４－氨基－６－羥基嘧啶，經(jīng)亞硝基化、還原得２－巰基－４，５－二氨基－６－羥基嘧啶，然后在活性鎳的作用下，消除巰基得４，５－二氨基－６－羥基嘧啶，進(jìn)一步與甲酸環(huán)合成６－羥基嘌呤，然后在吡啶溶液中與五硫化二

27、磷在１１８℃反應(yīng)４ｈ制得巰嘌呤。,,（一）鑒別（１）本品加乙醇溶解后，與醋酸鉛乙醇溶液反應(yīng)，生成巰嘌呤鉛黃色沉淀。,,（２）巰嘌呤分子上的巰基（—ＳＨ）與強(qiáng)氧化劑濃硝酸作用，被氧化成６－嘌呤亞磺酸，進(jìn)一步氧化成黃色的６－嘌呤磺酸，再與氫氧化鈉試液反應(yīng)，生成呈黃棕色的６－嘌呤磺酸鈉。,,（３）巰嘌呤分子上的巰基（—ＳＨ）與氨試液反應(yīng)，生成銨鹽，溶解度增大，溶液變澄清，再與硝酸銀試液反應(yīng)，生成溶解度較小的巰嘌呤銀白色絮狀沉淀，在

28、熱硝酸中不溶。（４）本品的紅外光吸收?qǐng)D譜應(yīng)與對(duì)照的圖譜一致。,（二）檢查１. ６－羥基嘌呤　 ６－羥基嘌呤為巰嘌呤的合成中間體，其結(jié)構(gòu)與巰嘌呤僅差一個(gè)取代基：一個(gè)是羥基取代，一個(gè)是巰基取代。精制不完全會(huì)有殘留，對(duì)巰嘌呤的安全使用有影響。 《中國(guó)藥典》（２０１５年版） 利用兩者在紫外吸收?qǐng)D譜上的差異，采用紫外－可見(jiàn)分光光度法對(duì)６－羥基嘌呤的量進(jìn)行控制，巰嘌呤在３２５ｎｍ處具有強(qiáng)烈的紫

29、外吸收，而６－羥基嘌呤的最大吸收波長(zhǎng)在２５５ｎｍ、３２５ｎｍ處基本無(wú)吸收，故通過(guò)規(guī)定２５５ｎｍ與３２５ｎｍ波長(zhǎng)處的吸光度比值不得過(guò)０.０６，即可對(duì)６－羥基嘌呤的量進(jìn)行控制。,,２.硫酸鹽　 本品在生產(chǎn)過(guò)程中可能產(chǎn)生硫酸鹽雜質(zhì)， 《中國(guó)藥典》（２０１５年版） 采用在鹽酸溶液中，不得與氯化鋇反應(yīng)產(chǎn)生渾濁現(xiàn)象來(lái)控制硫酸鹽雜質(zhì)。３.水分　 對(duì)于含有結(jié)晶水的藥物需對(duì)其水分進(jìn)行測(cè)定，巰嘌呤水分的含量約為１０.６％

30、， 《中國(guó)藥典》（２０１５年版） 規(guī)定采用費(fèi)休氏法測(cè)定水分，含量應(yīng)在１０.０％ ～１２.０％。,,４.重金屬　 巰嘌呤分子結(jié)構(gòu)中含有可與重金屬結(jié)合的巰基，采用第一法進(jìn)行重金屬檢查會(huì)產(chǎn)生假陰性的結(jié)果，故《中國(guó)藥典》（２０１５年版）采用第二法（熾灼后的硫代乙酰胺法）對(duì)巰嘌呤中的重金屬進(jìn)行檢查。該法需先將供試品高溫?zé)胱破茐某蔁o(wú)機(jī)物后再進(jìn)行重金屬檢查，熾灼溫度對(duì)檢查結(jié)果影響較大，溫度越高，重金屬損失越多，因此熾灼溫度應(yīng)控

31、制在５００℃ ～６００℃。,（三）含量測(cè)定,巰嘌呤具有很強(qiáng)的紫外吸收，在０.１ｍｏｌ／Ｌ鹽酸溶液中，其最大吸收波長(zhǎng)３２５ｎｍ處的吸收系數(shù)可達(dá)１２６５?！吨袊?guó)藥典》（２０１５年版） 采用紫外分光光度法中的吸收系數(shù)法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。具體方法：取本品，精密稱(chēng)定，加０.１ｍｏｌ／Ｌ鹽酸溶液溶解并定量稀釋至每１ｍｌ中約含５μｇ的溶液，照紫外可見(jiàn)分光光度法，在３２５ｎｍ的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，Ｃ５Ｈ４Ｎ４Ｓ的吸收系數(shù)（Ｅ１％１ｃｍ）為１

32、２６５，計(jì)算即得。,二、三磷酸腺苷二鈉 三磷酸腺苷二鈉為核苷酸衍生物，直接參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖、核酸以及核苷酸的代謝，與組織生長(zhǎng)、修補(bǔ)及再生均有密切關(guān)系，是體內(nèi)能量的主要來(lái)源，能擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈及周?chē)?，具有改善機(jī)體代謝的作用。 藥用三磷酸腺苷二鈉為二鈉鹽，含３個(gè)結(jié)晶水。臨床上主要用于心力衰竭、心肌炎、腦動(dòng)脈硬化、腦出血后遺癥、急性脊髓灰質(zhì)炎、進(jìn)行性肌肉萎縮等疾病

33、的治療。目前三磷酸腺苷二鈉生產(chǎn)方法主要為發(fā)酵法。以腺嘌呤核苷酸為原料，在啤酒酵母的發(fā)酵條件下生成三磷酸腺苷，然后進(jìn)一步純化、結(jié)晶成三磷酸腺苷二鈉。,（一）鑒別（１）取本品約２０ｍｇ，加稀硝酸２ｍｌ溶解后，加鉬酸銨試液１ｍｌ，水浴加熱，放冷，即析出黃色沉淀。此鑒別反應(yīng)可驗(yàn)證其是否為磷酸鹽。（２）取本品水溶液（３→１００００）３ｍｌ，加３，５－二 羥基甲苯乙醇溶液（１→１０）０.２ｍｌ，加硫酸亞鐵銨鹽酸溶液（１→１０００）３ｍｌ

34、，置水浴中加熱１０ｍｉｎ，即顯綠色。此鑒別反應(yīng)為核糖基的地衣酚反應(yīng)。（３）本品的紅外吸收?qǐng)D譜應(yīng)與對(duì)照的圖譜（《藥品紅外光譜集》９０３圖）一致。主要比較下列幾個(gè)特征吸收譜帶的峰型、峰位及相對(duì)強(qiáng)度是否一致。（４）本品為鈉鹽，也需對(duì)其進(jìn)行鑒別。《中國(guó)藥典》規(guī)定采用焰色反應(yīng)進(jìn)行鑒別。,（二）檢查 三磷酸腺苷二鈉主要采用發(fā)酵法進(jìn)行制備，以腺嘌呤核苷酸為原料，在啤酒酵母的發(fā)酵條件下生成三磷酸腺苷，然后進(jìn)一步純化、結(jié)晶成三

35、磷酸腺苷二鈉。 根據(jù)生產(chǎn)過(guò)程及貯藏過(guò)程中可能產(chǎn)生雜質(zhì)的情況，需要進(jìn)行酸度、溶液的澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、水分、氯化物、重金屬、鐵鹽和細(xì)菌內(nèi)毒素等８項(xiàng)檢查。,１.酸度　 三磷酸腺苷二鈉雖然為鈉鹽，但總體仍呈現(xiàn)為酸性，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求本品用水制成５０ｍｇ／ｍｌ的溶液，其ｐＨ值應(yīng)為２.５～３.５。２.有關(guān)物質(zhì)　 本品對(duì)溫度較敏感，在常溫下易分解為二磷酸腺苷二鈉和一磷酸腺苷鈉。發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生

36、的二磷酸腺苷、一磷酸腺苷等副產(chǎn)物在純化、結(jié)晶過(guò)程中也會(huì)一起形成二磷酸腺苷二鈉和一磷酸腺苷鈉，結(jié)構(gòu)與三磷酸腺苷二鈉類(lèi)似，難以完全除去。 本品的有關(guān)物質(zhì)檢查主要控制的就是這兩個(gè)雜質(zhì)的含量，具體檢查內(nèi)容如下：照含量測(cè)定項(xiàng)下三磷酸腺苷二鈉的重量比的方法測(cè)定，按下式計(jì)算不得大于５.０％。,,３.水分　 三磷酸腺苷二鈉含有３個(gè)結(jié)晶水，理論含水量為８.９％， 《中國(guó)藥典》（２０１５年版）采用卡氏水分測(cè)定法

37、測(cè)定其含水量應(yīng)在６.０％ ～１２.０％。 由于三磷酸腺苷二鈉幾乎不溶于乙醇、乙醚、三氯甲烷等有機(jī)溶劑，在甲醇中溶解度低，因此采用乙二醇－無(wú)水甲醇（６０∶４０）作為溶劑。檢測(cè)時(shí)攪拌速度、時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大，一般需攪拌１０ｍｉｎ左右，使樣品完全溶解后再滴定。,（三）含量測(cè)定 由于二磷酸腺苷二鈉和一磷酸腺苷鈉等雜質(zhì)的干擾難以除去，故本品采用先測(cè)定總核苷酸含量和三磷酸腺苷二鈉的重量比，然后通

38、過(guò)計(jì)算獲得三磷酸腺苷二鈉的準(zhǔn)確含量，具體方法如下。１.總核苷酸的含量測(cè)定　取本品適量，精密稱(chēng)定，加０.１ｍｏｌ／Ｌ磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鈉３５.８ｇ，加水至１０００ｍｌ作為Ａ液，取無(wú)水磷酸二氫鉀１３.６ｇ，加水至１０００ｍｌ作為Ｂ液，取Ｂ液適量，加入Ａ液中，調(diào)ｐＨ值至７.０，使溶解并定量稀釋制成每１ｍｌ中含２０μｇ的溶液，照紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定，在２５９ｎｍ的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按Ｃ１０Ｈ１４Ｎ５Ｎａ２Ｏ１３Ｐ３的吸收系

39、數(shù)（Ｅ１％１ｃｍ）為２７９計(jì)算。,２.三磷酸腺苷二鈉的重量比的測(cè)定　照高效液相色譜法測(cè)定（１）色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)　 用末端封尾的十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以０.２ｍｏｌ／Ｌ磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鈉３５.８ｇ，磷酸氫二鉀１３.６ｇ，加水９００ｍｌ溶解，用１ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ｐＨ 值至７.０， 加入四丁基溴化銨１.６１ｇ，加水至１０００ｍｌ， 搖勻） －甲醇（９５∶５）為流動(dòng)相，柱溫為３５℃，檢測(cè)波長(zhǎng)

40、為２５９ｎｍ，理論板數(shù)按三磷酸腺苷二鈉峰計(jì)算不低于１５００，出峰次序依次為一磷酸腺苷鈉、二磷酸腺苷二鈉與三磷酸腺苷二鈉，各色譜峰的分離度應(yīng)符合要求（圖８－１）,（２）測(cè)定法　 取本品適量，精密稱(chēng)定，加流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成每１ｍｌ含０.４ｍｇ的溶液，精密量?。保唉蹋熳⑷胍合嗌V儀，記錄色譜圖，計(jì)算三磷酸腺苷二鈉在總核苷酸中的重量比。,,３.三磷酸腺苷二鈉含量的計(jì)算 三磷酸

41、腺苷二鈉含量％ ＝ （總核苷酸×三磷酸腺苷二鈉的重量比） ×１００％式中各符號(hào)的含義同有關(guān)物質(zhì)檢查的計(jì)算公式。,一、鑒別,（一）化學(xué)鑒別 １戊糖的鑒別 （１）地衣酚反應(yīng)　 （２）二苯胺反應(yīng) ２磷酸鹽的鑒別  ３嘌呤堿的鑒別（二）光譜鑒別 １. 紫外吸收光譜

42、法 ２. 紅外吸收光譜法,二、檢查,核糖核酸、脫氧核苷酸鈉多采用提取法制備，核酸堿基、核苷、核苷酸類(lèi)藥物大多采用酶解法、發(fā)酵法和半合成法制備。（一）多核苷酸類(lèi)藥物的檢查 １吸光度 ２核糖核酸中脫氧核糖核酸的檢查 ３增色效應(yīng)（二）核苷酸、核苷、核酸堿基類(lèi)藥物的檢查 １有關(guān)物質(zhì)　

43、 結(jié)構(gòu)相似的其他非目標(biāo)化合物，即有關(guān)物質(zhì)。 2 含氯量 ３含氟量,三、含量測(cè)定,1、核酸類(lèi)藥物結(jié)構(gòu)中的嘧啶堿和嘌呤堿，具有一定的弱堿性，可采用非水堿量法進(jìn)行含量測(cè)定；2、其共軛結(jié)構(gòu)具有一定的紫外吸收，可通過(guò)測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)的吸光度來(lái)測(cè)定含量3、紫外檢測(cè)器的ＨＰＬＣ法定量。 大多數(shù)核酸類(lèi)藥物可用常規(guī)的反相高效液相色譜法進(jìn)行分離測(cè)