松材線蟲lin-39基因的表達(dá)特性與功能驗(yàn)證研究.pdf

1、松材線蟲病是一種由松材線蟲引起的林業(yè)毀滅性病害，在我國(guó)多個(gè)省市嚴(yán)重發(fā)生，造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)松材線蟲病開展了大量的研究，但針對(duì)松材線蟲本身的基礎(chǔ)性研究相對(duì)薄弱。HOX基因是一類進(jìn)化保守的發(fā)育調(diào)控基因家族，在動(dòng)物的胚胎發(fā)育和器官形成過程中具有重要的軸向調(diào)控作用。lin-39基因是松材線蟲HOX基因家族的五個(gè)成員之一，研究松材線蟲lin-39基因的表達(dá)特性和調(diào)控功能，有助于揭示松材線蟲的個(gè)體發(fā)育調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步探索特異性

2、的松材線蟲病防控措施提供基礎(chǔ)。為此，本研究對(duì)松材線蟲lin-39基因的表達(dá)調(diào)控開展了系統(tǒng)研究，應(yīng)用生物信息學(xué)分析該基因啟動(dòng)子保守的結(jié)構(gòu)域motifs，預(yù)測(cè)編碼區(qū)蛋白功能結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建lin-39基因在多種生物之間的進(jìn)化樹；應(yīng)用mRNA原位雜交和轉(zhuǎn)基因熒光標(biāo)記技術(shù)分析其時(shí)空表達(dá)特性，實(shí)時(shí)定量PCR展示其在個(gè)體發(fā)育的動(dòng)態(tài)表達(dá)；采用RNAi技術(shù)及行為學(xué)測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在松材線蟲個(gè)體發(fā)育中的調(diào)控功能。研究結(jié)果如下：
　　1、啟動(dòng)子分析

3、結(jié)果表明，松材線蟲與秀麗隱桿線蟲共享3個(gè)保守且排列順序相同的motifs，顯示lin-39基因在線蟲個(gè)體發(fā)育過程中調(diào)控機(jī)制的保守性。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，lin-39是含有保守同源結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步通過蛋白序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)即使在線蟲分支內(nèi)部，保守區(qū)域也僅限于同源結(jié)構(gòu)域，表明高度保守的HOX基因在不同線蟲種類之間也存在較大的差異；進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，lin-39基因能夠很好地反應(yīng)線蟲內(nèi)部不同種類之間的親緣關(guān)系。
　　2、應(yīng)用mR

4、NA原位雜交技術(shù)，明確了lin-39基因在松材線蟲的不同發(fā)育時(shí)期和不同性別個(gè)體上的時(shí)空動(dòng)態(tài)表達(dá)，即胚胎期的表達(dá)部位為身體的中前部，J3期的表達(dá)部位為身體中后部，成蟲期在雌蟲陰戶和雄蟲交合刺尖端表達(dá)，但J2和J4期均未見其表達(dá)。
　　3、首次采用轉(zhuǎn)基因顯微注射技術(shù)分析了松材線蟲lin-39在秀麗隱桿線蟲中的表達(dá)特性研究。應(yīng)用in-fusion克隆技術(shù)，將松材線蟲lin-39的啟動(dòng)子區(qū)域或全長(zhǎng)區(qū)域包括啟動(dòng)子、內(nèi)含子和外顯子插入到mCh

5、erry報(bào)告基因上游，構(gòu)建表達(dá)載體，再將上述表達(dá)載體注射到秀麗隱桿線蟲的性腺，觀察其在蛋白水平上的動(dòng)態(tài)表達(dá)，并與mRNA水平的原位雜交結(jié)果進(jìn)行比較，進(jìn)一步確認(rèn)了松材線蟲lin-39的動(dòng)態(tài)表達(dá)特性。
　　4、通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了lin-39基因在松材線蟲不同發(fā)育時(shí)期的動(dòng)態(tài)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)lin-39基因在松材線蟲胚胎期的表達(dá)量較高，其次是幼蟲期，成蟲期的表達(dá)量相對(duì)較低，不同發(fā)育階段的表達(dá)差異達(dá)顯著水平。這表明lin-39基因?qū)?/p>

6、松材線蟲早期胚胎發(fā)育的軀體定位和軸向發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，并在胚胎期和幼蟲期完成對(duì)晚期器官（如陰戶等）發(fā)育的調(diào)控作用。
　　5、采用RNAi干擾技術(shù)，明確了lin-39基因?qū)λ刹木€蟲不同發(fā)育時(shí)期的調(diào)控作用。在胚胎期，lin-39基因被干擾之后會(huì)引起胚胎畸形，卵的孵化率明顯下降，只有±2.5％，顯著低于對(duì)照±95%的孵化率；在J2早期，lin-39基因被干擾之后會(huì)導(dǎo)致雌蟲陰戶發(fā)育明顯滯后；在J3期和J4期，均未見顯著表型差異。行為