EphB4受體及其配體EphrinB2 mRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率逐年上升。明確子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，尋找診斷和治療的有效方法，成為擺在我們面前的嚴(yán)峻課題。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展需要持續(xù)的血管生成，這一過(guò)程有多種生長(zhǎng)因子的參與。紅細(xì)胞生成素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞受體(Erythropoietin-producinghepatocellular，Eph)及其配體Ephrin是酪氨酸激酶受體家族成員之一，是一種新型促血管生成因子。研究表明，多種Eph受體及其

2、配體參與了腫瘤的血管生成過(guò)程，其中EphB4受體及其配體EphrinB2在血管生成中的作用尤為引人關(guān)注，已證實(shí)在人體多種腫瘤中表達(dá)升高，但它們?cè)谧訉m內(nèi)膜癌中的作用報(bào)道較少。本研究采用RT-PCR法檢測(cè)EphB4受體及其配體EphrinB2在子宮內(nèi)膜癌組織及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，以明確它們與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為潛在的以EphB4/EphrinB2為靶點(diǎn)的抗血管生成治療提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)材料與方法:一、資料來(lái)源選取中

3、國(guó)醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院2003年10月至2005年1月婦科手術(shù)切除的33例子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本和10例經(jīng)手術(shù)或診刮后病理證實(shí)的正常子宮內(nèi)膜。根據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2000年手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期18例，Ⅱ期9例，Ⅲ～Ⅳ期6例。28例子宮內(nèi)膜樣腺癌，3例鱗腺癌，2例漿液性腺癌。組織學(xué)分級(jí)G110例，G2～G323例。伴有深肌層浸潤(rùn)12例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例。年齡31～71歲，平均59歲。標(biāo)本采取后迅速置于液氮中冷凍，然后送于-70℃冰箱中

4、保存。所有病例均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)。術(shù)前未經(jīng)放、化療或激素治療。 二、主要試劑EphB4、EphrinB2及內(nèi)對(duì)照引物、RT-PCR試劑盒、TRIzol試劑等。 三、主要儀器PCR擴(kuò)增儀、電泳凝膠成像及自動(dòng)分析系統(tǒng)、電泳儀等。 四、實(shí)驗(yàn)方法1.提取總RNA：采取TRIzol一步法。 2.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。 3.PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析 引物序列：EphB4、Ephr

5、inB2及β-actin引物利用Primier5.0軟件自行設(shè)計(jì)，詳見(jiàn)正文。 PCR反應(yīng)：由cDNA3μl；Buffer(10×)2.5μl；dNTPs(10mmol/L)2μl；Taq酶(5U/μl)0.2μl；引物各0.1μl；dd·H2O16.7μl組成反應(yīng)體系。經(jīng)90℃預(yù)變性3分鐘后，進(jìn)入循環(huán)，94℃45秒變性，54℃60秒退火，72℃60秒延伸，在擴(kuò)增儀上進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后72℃延伸7分鐘。 取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行2

6、％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并拍照，Olympus電泳凝膠成像及自動(dòng)分析系統(tǒng)攝像、打印、檢測(cè)各擴(kuò)增帶的產(chǎn)物含量。用marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，β-actin作為內(nèi)對(duì)照，皮膚組織標(biāo)本代替實(shí)驗(yàn)標(biāo)本作為陰性對(duì)照。 五、結(jié)果判定PCR產(chǎn)物量作為衡量相應(yīng)基因表達(dá)水平的半定量指標(biāo)，將電泳凝膠置于凝膠掃描儀進(jìn)行DNA條帶和光量子強(qiáng)度分析，PCR產(chǎn)物量以光密度Int×面積來(lái)表示。EphB4mRNA的相對(duì)含量通過(guò)電泳后條帶密度與內(nèi)參照密度比值進(jìn)

7、行計(jì)算。EphB4mRNA的相對(duì)含量=EphB4的密度/β-ac-tin的密度×100。同法計(jì)算EphrinB2mRNA的相對(duì)含量。在電泳PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)EphB4509bp的分子條帶及內(nèi)參照β-actin690bp分子條帶為陽(yáng)性結(jié)果。如出現(xiàn)EphrinB2503bp的分子條帶及內(nèi)參照β-actin690bp分子條帶亦為陽(yáng)性結(jié)果。如僅出現(xiàn)內(nèi)參照β-actin690bp分子條帶為陰性結(jié)果。 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS10.0進(jìn)行統(tǒng)

8、計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。相對(duì)含量比較采用方差分析或t檢驗(yàn)，表達(dá)率的比較采用×2檢驗(yàn)或Fisher's精確概率法。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:一、EphB4mRNA和EphrinB2mRNA在子宮內(nèi)膜癌以及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況 EphB4mRNA在子宮內(nèi)膜癌組的表達(dá)率和相對(duì)含量均高于正常子宮內(nèi)膜組，有顯著差異p＜0.05，p＜0.05。EphrinB2mRNA在子宮內(nèi)膜癌組的表達(dá)率和相對(duì)含量均高于正常子宮內(nèi)膜組，有顯

9、著差異p＜0.05，p＜0.01。 二、EphB4mRNA和EphrinB2mRNA的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系 1、EphB4mRNA在Ⅲ～Ⅳ期組織中的表達(dá)率與Ⅰ、Ⅱ期比較有增高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＞0.05)。其相對(duì)含量Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ、Ⅱ期，各組間比較差異有顯著性，(p＜0.05)。EphrinB2mRNA在Ⅲ～Ⅳ期組織中的表達(dá)率與Ⅰ、Ⅱ期比較差異無(wú)顯著性，(P＞0.05)。其相對(duì)含量Ⅲ～Ⅳ期明顯高于Ⅰ

10、期(p＜0.01)，但Ⅲ～Ⅳ期與Ⅱ期比較，差異無(wú)顯著性，(p＞0.05)。 2、G2～G3及G1子宮內(nèi)膜癌EphB4mRNA的表達(dá)率經(jīng)比較有極顯著性差異(p＜0.01)。其相對(duì)含量G2～G3與G1相比，亦有極顯著差異(p＜0.01)。G2～G3及G1子宮內(nèi)膜癌EphrinB2mRNA的表達(dá)率經(jīng)比較有顯著性差異(p＜0.05)。其相對(duì)含量G2～G3與G1相比，差異有顯著性(p＜0.05)。 3、子宮內(nèi)膜樣腺癌、鱗腺癌及漿液

11、性腺癌EphB4mRNA的表達(dá)率各組間比較無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。其相對(duì)含量各組間比較亦無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。子宮內(nèi)膜樣腺癌、鱗腺癌及漿液性腺癌EphrinB2mRNA的表達(dá)率各組間比較無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。其相對(duì)含量各組間比較亦無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。 4、深肌層浸潤(rùn)(浸潤(rùn)深度≥1/2肌層)組子宮內(nèi)膜癌EphB4mRNA表達(dá)率與淺肌層浸潤(rùn)(浸潤(rùn)深度＜1/2肌層)組比較，差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。

12、其相對(duì)含量深肌層浸潤(rùn)組雖高于淺肌層浸潤(rùn)組，但差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。深肌層浸潤(rùn)組子宮內(nèi)膜癌EphrinB2mRNA表達(dá)率與淺肌層浸潤(rùn)組比較，差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。其相對(duì)含量?jī)山M相比差異亦無(wú)顯著性(p＞0.05)。 5、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組子宮內(nèi)膜癌EphB4mRNA的表達(dá)率與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。其相對(duì)含量有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組雖高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，但差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組子宮內(nèi)

13、膜癌EphrinB2mRNA的表達(dá)率與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。其相對(duì)含量?jī)山M比較，無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。 結(jié)論:一、EphB4/EphrinB2與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)，可能是衡量子宮內(nèi)膜病變良惡性的又一指標(biāo)。 二、EphB4/EphrinB2在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展中起重要作用，并可能作為對(duì)其惡性程度及病情進(jìn)行評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一。 三、EphB4mRNA.和EphrinB2mRNA的表達(dá)與