輔激活物對MG63細胞成骨分化的作用機制及補腎中藥對去勢大鼠SRC-的影響.pdf

1、骨質疏松癥是以骨量減少，骨的微觀結構破壞，導致骨的脆性增加，容易發(fā)生脆性骨折為特征的全身性骨骼疾病。本病的發(fā)生與性別及年齡相關，多見于絕經后女性及老年男性。本文主要研究與雌激素缺乏密切相關的絕經后骨質疏松癥(Postmenopausal osteoporosis，PMO)。由于絕經后婦女的卵巢機能或功能低下，導致雌激素的分泌水平下降，負反饋調節(jié)垂體和下丘腦的作用減弱，使得雌二醇、生長素和甲狀腺激素下降，促卵泡素和黃體生成素上升，最終導致

2、骨吸收增加。在細胞水平，骨丟失是由于破骨細胞與成骨細胞的功能活動失衡所致。而絕經后骨質疏松癥是屬于骨吸收及骨形成均活躍，而骨吸收活動大于骨形成的高轉換型骨質疏松癥。研究發(fā)現(xiàn)，核受體ER及ERR-α均參與雌激素調節(jié)骨骼代謝的過程。配體與核受體結合后，引起核受體的構象變化，進而激活了核受體，導致基因表達的上調或下調。核受體的轉錄活性也受到輔激活物的調控，對核受體調控的基因表達有重要作用。輔激活物中的SRC家族通過調節(jié)ER活性以影響骨代謝，而

3、PGC-1家族通過與ERRα相互作用來調節(jié)骨健康。
　　骨組織作為人體一個龐大而復雜的系統(tǒng)，通過多種細胞在激素、神經及細胞因子等的作用下完成正常生理活動。本文主要進一步探討輔激活物SRC-3及PGC-1a在骨代謝中的作用機制，并初步探討補腎壯骨方防治絕經后骨質疏松癥的機理，為中醫(yī)藥防治疾病提供分子理論支持，同時為絕經后骨質疏松癥的預防和治療提供更多的選擇。
　　目的:
　　探討輔激活物SRC-3、PGC-1α對MG63

4、細胞成骨分化的作用機制;觀察補腎壯骨顆粒對去勢大鼠骨密度、骨代謝相關指標及輔激活物SRC-3的影響。
　　方法:
　　1、細胞研究
　　通過腺病毒沉默或高表達技術，研究輔激活物SRC-3和PGC-1a在MG63細胞中的成骨分化及增殖等作用。采用MTT檢測細胞增殖能力，ALP活性檢測細胞的成骨能力，并進一步采用real-time PCR檢測MG63細胞表達成骨特異基因ERRa，OPN，Runx2，Osteocalcin，

5、Osterix mRNA的水平，Western blot檢測細胞MAPK信號通路中的P38MAKP、JNK及ERK1/2的磷酸化水平等。同時應用MAPK通路阻滯劑，通過ALP活性檢測、real-time PCR檢測及Western-blotting檢測探討SRC-3、PGC-1a在MG63細胞向成骨分化過程中，對MAPK信號通路中相關蛋白表達的影響。
　　2、動物研究
　　通過去勢大鼠建立絕經后骨質疏松癥模型，同時應用補腎壯

6、骨顆粒進行干預，以阿侖膦酸鈉(ALEN)作為陽性對照，采用DXA檢測、ELISA及real-time PCR等技術研究補腎壯骨顆粒對大鼠左側股骨骨密度，外周血PINP、CTX、SRC-3水平，及股骨骨髓中SRC-3 mRNA的表達。
　　結果:
　　1、腺病毒攜帶SRC-3和PGC-1α經P38MAPK通路調控MG63成骨分化
　　1.1、人SRC-3和PGC-1α基因沉默和高表達腺病毒構建與鑒定
　　沉默組腺病

7、毒的構建與鑒定:通過real-time PCR和Western blot篩選出沉默效率最高的siSRC-3-3和siPGC-1a-1序列，設計并合成相對應的shRNA序列，提取重組穿梭質粒，再轉染293A細胞以擴增病毒，獲取Adeno-shSRC-3、Adeno-shPGC-1a及Adeno-shCon（陰性對照）的病毒滴度分別為0.98×109ifu/mL、1.30×109ifu/mL和1.95×109 ifu/mL。感染MG63細胞

8、后，用qPCR和Western blot驗證目的基因及蛋白的沉默效果，表明腺病毒攜帶的shSRC-3和shPGC-1a對SRC-3和PGC-1α的沉默效果較好。
　　高表達組腺病毒的構建與鑒定:數(shù)據(jù)庫內查詢SRC-3和PGC-1a核苷酸序列，以cDNA為模板，進行大量擴增，添加重組穿梭質粒的多克隆位點，構建重組穿梭質粒構，并轉染293A細胞以擴增病毒，獲取pAD-SRC-3、pAD-PGC-1a及pAD-Con（陰性對照）的病毒滴

9、度分別為0.18×109 ifu/mL、0.43×109 ifu/mL和0.89×109i fu/mL。感染MG63細胞后，用qPCR和Western blot法檢測到SRC-3和PGC-1α的存在，表明腺病毒攜帶的SRC-3和PGC-1α能夠正常表達。
　　1.2、沉默或高表達腺病毒轉染MG63細胞的增殖與成骨能力檢測
　　MG63細胞的增殖能力:沉默組的Ad-shSRC-3+Ad-shPGC-1a組對MG63的增殖抑制能

10、力最強，其次為Ad-shPGC-1a組，最后為Ad-shSRC-3組:高表達組的pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a組對MG63促進增殖的能力最強，且在72h時的細胞增殖能力較沉默組均較高(P＜0.05)。
　　ALP活性檢測MG63的成骨能力:轉染MG63細胞24h及48h后，各沉默組及各高表達組之間的ALP活性無差別(P＞0.05)。而在轉染72h后，各組之間的ALP活性有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且pAd-SRC-3+

11、pAd-PGC-1a組的ALP活性高于其他組，與Ad-shSRC-3+Ad-shPGC-1a組及pAd-Con組比較具有統(tǒng)計學差異（P=0.024，P=0.023）;其余各組組內兩兩比較無統(tǒng)計學差異(均為P＞0.05)。
　　MG63細胞中成骨相關基因ERRα、OPN、Runx2 mRNA等基因的表達:轉染MG63細胞48h后提取細胞總RNA，高表達組的pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a組的ERRa、Runx2、Osteoc

12、alcin及Osterix mRNA表達水平均明顯高于其他組（分別為P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001），而沉默組的Ad-shSRC-3+Ad-shPGC-1a組是最低的;各組之間的OPN mRNA表達水平無差別(P＞0.05)。
　　MG63細胞中P38MAPK、JNK、ERK1/2等蛋白的磷酸化水平:轉染MG63細胞48h后提取細胞總蛋白，高表達組的pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a組P-P3

13、8MAPK蛋白的表達水平明顯高于沉默組、pAD-Con組及pAD-SRC-3組pAd-Con組(p＜0.01);而各組p38MAPK、JNK、P-JNK、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表達水平差異不大。
　　1.3、 MAPK通路阻滯劑干預沉默或高表達腺病毒轉染MG63細胞后的細胞成骨能力
　　3個MAPK通路阻滯劑干預后MG63細胞的ALP活性:pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a組的ALP活性比各對照組均高(

14、P＜0.001)，而與pAd-SRC-3+pAd-PGC-1 a+SP600125組和pAd-SRC-3+pAd-PGC-1 a+PD98059組無差別(P＞0.05);而pAd-SRC-3+pAd-PGC-1 a+SB203580組的ALP活性較pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a組明顯下降(P＜0.001)，說明重組腺病毒介導pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a雙基因聯(lián)合轉染MG63細胞干預可促進ALP活性，經阻滯劑SB

15、203580干預后可阻斷ALP活性，而經阻滯劑SP600125及PD98059干預后ALP活性變化不大。
　　3個MAPK通路阻滯劑干預后MG63細胞中P38MAPK、JNK、ERK1/2等蛋白的磷酸化水平:阻滯劑干預MG63細胞48h后提取細胞總蛋白，pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a組P-P38MAPK蛋白的表達水平明顯高于Control組(P＜0.01)，而pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1 a+SB20358

16、0組與Control組無差別(P＞0.05);而各組p38MAPK、JNK、P-JNK、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表達水平差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a組可促進P-p38MAPK蛋白的表達，而p38MAPK通路阻滯劑可抑制其表達。
　　p38MAPK阻滯劑SP600125干預后MG63細胞中成骨相關基因ERRα、Runx2、Osteocalcin、Osterix mRNA

17、等的表達:經P38MAPK阻滯劑SB203580處理MG63細胞48h后提取總RNA，SRC-3、PGC-1a共高表達可促進MG63中ERRa、Osteocalcin及Osterix mRNA的表達水平，而P38MAPK通路阻滯劑SB203580可阻斷其表達;但SRC-3、PGC-1a共高表達對MG63的Runx2 mRNA表達無顯著性影響。
　　2、補腎中藥復方促去勢大鼠骨質疏松骨形成中對SRC-3和PGC-1α表達的影響

18、>　　2.1、補腎中藥復方可提高去勢大鼠骨密度
　　干預12周后骨密度變化:OVX組的大鼠左側離體股骨骨密度低于Sham組(*P＜0.001)，說明骨質疏松癥大鼠模型造模成功。BSZG組與ALEN組的骨密度均比OVX組高（均為P＜0.01）;而BSZG組與ALEN組之間的骨密度差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明BSZG組可有效防治OVX模型大鼠的骨質疏松癥，且與ALEN組的效果相當。
　　2.2、補腎中藥復方對去勢大鼠血

19、清學指標的影響
　　OVX組的血清PINP、CTX水平高于Sham組(P＜0.001)，且BSZG組及ALEN組的血清PINP、CTX水平均低于OVX組(P＜0.001)，而BSZG組與ALEN組之間的血清PINP、CTX水平無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。說明BSZG組及ALEN組均可降低去勢大鼠血清PINP、CTX水平，且二者作用相當。OVX組的血清SRC-3水平低于Sham組(P＜0.001);但BSZG組的血清SRC-3水平

20、顯著性高于OVX組和ALEN組（分別為P＜0.001，P＜0.05）。說明BSZG組可提高去勢大鼠血清SRC-3水平，優(yōu)于ALEN組。
　　2.3、補腎中藥復方對去勢大鼠SRC-3 mRNA表達的影響
　　OVX組、BSZG組及ALEN組的去勢大鼠股骨骨髓中SRC-3 mRNA的相對表達水平均低于Sham組(P＜0.05):但BSZG組的股骨骨髓中SRC-3 mRNA的相對表達水平高于OVX組(P＜0.05)，而ALEN組與

21、OVX組無差別(P＞0.05)。說明BSZG組可提高去勢大鼠股骨骨髓中SRC-3 mRNA的相對表達水平，且效果優(yōu)于ALEN組。
　　結論:
　　在細胞水平闡述了MG63中表達SRC-3和PGC-1α，通過腺病毒介導SRC-3和PGC-1α雙基因聯(lián)合高表達，轉染MG63后，促進了MG63增殖，激活了內源性ERRα的基因表達及P38MAPK通路，提高了ALP活性以及成骨特異基因Runx2、Osteocalcin、Osterix