輔激活物對(duì)MG63細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)制及補(bǔ)腎中藥對(duì)去勢(shì)大鼠SRC-的影響.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少，骨的微觀結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨的脆性增加，容易發(fā)生脆性骨折為特征的全身性骨骼疾病。本病的發(fā)生與性別及年齡相關(guān)，多見于絕經(jīng)后女性及老年男性。本文主要研究與雌激素缺乏密切相關(guān)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis，PMO)。由于絕經(jīng)后婦女的卵巢機(jī)能或功能低下，導(dǎo)致雌激素的分泌水平下降，負(fù)反饋調(diào)節(jié)垂體和下丘腦的作用減弱，使得雌二醇、生長(zhǎng)素和甲狀腺激素下降，促卵泡素和黃體生成素上升，最終導(dǎo)致

2、骨吸收增加。在細(xì)胞水平，骨丟失是由于破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的功能活動(dòng)失衡所致。而絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是屬于骨吸收及骨形成均活躍，而骨吸收活動(dòng)大于骨形成的高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥。研究發(fā)現(xiàn)，核受體ER及ERR-α均參與雌激素調(diào)節(jié)骨骼代謝的過程。配體與核受體結(jié)合后，引起核受體的構(gòu)象變化，進(jìn)而激活了核受體，導(dǎo)致基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)。核受體的轉(zhuǎn)錄活性也受到輔激活物的調(diào)控，對(duì)核受體調(diào)控的基因表達(dá)有重要作用。輔激活物中的SRC家族通過調(diào)節(jié)ER活性以影響骨代謝，而

3、PGC-1家族通過與ERRα相互作用來調(diào)節(jié)骨健康。
　　骨組織作為人體一個(gè)龐大而復(fù)雜的系統(tǒng)，通過多種細(xì)胞在激素、神經(jīng)及細(xì)胞因子等的作用下完成正常生理活動(dòng)。本文主要進(jìn)一步探討輔激活物SRC-3及PGC-1a在骨代謝中的作用機(jī)制，并初步探討補(bǔ)腎壯骨方防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機(jī)理，為中醫(yī)藥防治疾病提供分子理論支持，同時(shí)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療提供更多的選擇。
　　目的:
　　探討輔激活物SRC-3、PGC-1α對(duì)MG63

4、細(xì)胞成骨分化的作用機(jī)制;觀察補(bǔ)腎壯骨顆粒對(duì)去勢(shì)大鼠骨密度、骨代謝相關(guān)指標(biāo)及輔激活物SRC-3的影響。
　　方法:
　　1、細(xì)胞研究
　　通過腺病毒沉默或高表達(dá)技術(shù)，研究輔激活物SRC-3和PGC-1a在MG63細(xì)胞中的成骨分化及增殖等作用。采用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，ALP活性檢測(cè)細(xì)胞的成骨能力，并進(jìn)一步采用real-time PCR檢測(cè)MG63細(xì)胞表達(dá)成骨特異基因ERRa，OPN，Runx2，Osteocalcin，

5、Osterix mRNA的水平，Western blot檢測(cè)細(xì)胞MAPK信號(hào)通路中的P38MAKP、JNK及ERK1/2的磷酸化水平等。同時(shí)應(yīng)用MAPK通路阻滯劑，通過ALP活性檢測(cè)、real-time PCR檢測(cè)及Western-blotting檢測(cè)探討SRC-3、PGC-1a在MG63細(xì)胞向成骨分化過程中，對(duì)MAPK信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　2、動(dòng)物研究
　　通過去勢(shì)大鼠建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，同時(shí)應(yīng)用補(bǔ)腎壯

6、骨顆粒進(jìn)行干預(yù)，以阿侖膦酸鈉(ALEN)作為陽性對(duì)照，采用DXA檢測(cè)、ELISA及real-time PCR等技術(shù)研究補(bǔ)腎壯骨顆粒對(duì)大鼠左側(cè)股骨骨密度，外周血PINP、CTX、SRC-3水平，及股骨骨髓中SRC-3 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、腺病毒攜帶SRC-3和PGC-1α經(jīng)P38MAPK通路調(diào)控MG63成骨分化
　　1.1、人SRC-3和PGC-1α基因沉默和高表達(dá)腺病毒構(gòu)建與鑒定
　　沉默組腺病

7、毒的構(gòu)建與鑒定:通過real-time PCR和Western blot篩選出沉默效率最高的siSRC-3-3和siPGC-1a-1序列，設(shè)計(jì)并合成相對(duì)應(yīng)的shRNA序列，提取重組穿梭質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞以擴(kuò)增病毒，獲取Adeno-shSRC-3、Adeno-shPGC-1a及Adeno-shCon（陰性對(duì)照）的病毒滴度分別為0.98×109ifu/mL、1.30×109ifu/mL和1.95×109 ifu/mL。感染MG63細(xì)胞

8、后，用qPCR和Western blot驗(yàn)證目的基因及蛋白的沉默效果，表明腺病毒攜帶的shSRC-3和shPGC-1a對(duì)SRC-3和PGC-1α的沉默效果較好。
　　高表達(dá)組腺病毒的構(gòu)建與鑒定:數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)查詢SRC-3和PGC-1a核苷酸序列，以cDNA為模板，進(jìn)行大量擴(kuò)增，添加重組穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)，并轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞以擴(kuò)增病毒，獲取pAD-SRC-3、pAD-PGC-1a及pAD-Con（陰性對(duì)照）的病毒滴

9、度分別為0.18×109 ifu/mL、0.43×109 ifu/mL和0.89×109i fu/mL。感染MG63細(xì)胞后，用qPCR和Western blot法檢測(cè)到SRC-3和PGC-1α的存在，表明腺病毒攜帶的SRC-3和PGC-1α能夠正常表達(dá)。
　　1.2、沉默或高表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞的增殖與成骨能力檢測(cè)
　　MG63細(xì)胞的增殖能力:沉默組的Ad-shSRC-3+Ad-shPGC-1a組對(duì)MG63的增殖抑制能

10、力最強(qiáng)，其次為Ad-shPGC-1a組，最后為Ad-shSRC-3組:高表達(dá)組的pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a組對(duì)MG63促進(jìn)增殖的能力最強(qiáng)，且在72h時(shí)的細(xì)胞增殖能力較沉默組均較高(P＜0.05)。
　　ALP活性檢測(cè)MG63的成骨能力:轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞24h及48h后，各沉默組及各高表達(dá)組之間的ALP活性無差別(P＞0.05)。而在轉(zhuǎn)染72h后，各組之間的ALP活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且pAd-SRC-3+

11、pAd-PGC-1a組的ALP活性高于其他組，與Ad-shSRC-3+Ad-shPGC-1a組及pAd-Con組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.024，P=0.023）;其余各組組內(nèi)兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均為P＞0.05)。
　　MG63細(xì)胞中成骨相關(guān)基因ERRα、OPN、Runx2 mRNA等基因的表達(dá):轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞48h后提取細(xì)胞總RNA，高表達(dá)組的pAd-SRC-3+pAd-PGC-1a組的ERRa、Runx2、Osteoc

12、alcin及Osterix mRNA表達(dá)水平均明顯高于其他組（分別為P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001），而沉默組的Ad-shSRC-3+Ad-shPGC-1a組是最低的;各組之間的OPN mRNA表達(dá)水平無差別(P＞0.05)。
　　MG63細(xì)胞中P38MAPK、JNK、ERK1/2等蛋白的磷酸化水平:轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞48h后提取細(xì)胞總蛋白，高表達(dá)組的pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a組P-P3

13、8MAPK蛋白的表達(dá)水平明顯高于沉默組、pAD-Con組及pAD-SRC-3組pAd-Con組(p＜0.01);而各組p38MAPK、JNK、P-JNK、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平差異不大。
　　1.3、 MAPK通路阻滯劑干預(yù)沉默或高表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞后的細(xì)胞成骨能力
　　3個(gè)MAPK通路阻滯劑干預(yù)后MG63細(xì)胞的ALP活性:pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a組的ALP活性比各對(duì)照組均高(

14、P＜0.001)，而與pAd-SRC-3+pAd-PGC-1 a+SP600125組和pAd-SRC-3+pAd-PGC-1 a+PD98059組無差別(P＞0.05);而pAd-SRC-3+pAd-PGC-1 a+SB203580組的ALP活性較pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a組明顯下降(P＜0.001)，說明重組腺病毒介導(dǎo)pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞干預(yù)可促進(jìn)ALP活性，經(jīng)阻滯劑SB

15、203580干預(yù)后可阻斷ALP活性，而經(jīng)阻滯劑SP600125及PD98059干預(yù)后ALP活性變化不大。
　　3個(gè)MAPK通路阻滯劑干預(yù)后MG63細(xì)胞中P38MAPK、JNK、ERK1/2等蛋白的磷酸化水平:阻滯劑干預(yù)MG63細(xì)胞48h后提取細(xì)胞總蛋白，pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a組P-P38MAPK蛋白的表達(dá)水平明顯高于Control組(P＜0.01)，而pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1 a+SB20358

16、0組與Control組無差別(P＞0.05);而各組p38MAPK、JNK、P-JNK、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明pAd-SRC-3+ pAd-PGC-1a組可促進(jìn)P-p38MAPK蛋白的表達(dá)，而p38MAPK通路阻滯劑可抑制其表達(dá)。
　　p38MAPK阻滯劑SP600125干預(yù)后MG63細(xì)胞中成骨相關(guān)基因ERRα、Runx2、Osteocalcin、Osterix mRNA

17、等的表達(dá):經(jīng)P38MAPK阻滯劑SB203580處理MG63細(xì)胞48h后提取總RNA，SRC-3、PGC-1a共高表達(dá)可促進(jìn)MG63中ERRa、Osteocalcin及Osterix mRNA的表達(dá)水平，而P38MAPK通路阻滯劑SB203580可阻斷其表達(dá);但SRC-3、PGC-1a共高表達(dá)對(duì)MG63的Runx2 mRNA表達(dá)無顯著性影響。
　　2、補(bǔ)腎中藥復(fù)方促去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松骨形成中對(duì)SRC-3和PGC-1α表達(dá)的影響

18、>　　2.1、補(bǔ)腎中藥復(fù)方可提高去勢(shì)大鼠骨密度
　　干預(yù)12周后骨密度變化:OVX組的大鼠左側(cè)離體股骨骨密度低于Sham組(*P＜0.001)，說明骨質(zhì)疏松癥大鼠模型造模成功。BSZG組與ALEN組的骨密度均比OVX組高（均為P＜0.01）;而BSZG組與ALEN組之間的骨密度差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說明BSZG組可有效防治OVX模型大鼠的骨質(zhì)疏松癥，且與ALEN組的效果相當(dāng)。
　　2.2、補(bǔ)腎中藥復(fù)方對(duì)去勢(shì)大鼠血

19、清學(xué)指標(biāo)的影響
　　OVX組的血清PINP、CTX水平高于Sham組(P＜0.001)，且BSZG組及ALEN組的血清PINP、CTX水平均低于OVX組(P＜0.001)，而BSZG組與ALEN組之間的血清PINP、CTX水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。說明BSZG組及ALEN組均可降低去勢(shì)大鼠血清PINP、CTX水平，且二者作用相當(dāng)。OVX組的血清SRC-3水平低于Sham組(P＜0.001);但BSZG組的血清SRC-3水平

20、顯著性高于OVX組和ALEN組（分別為P＜0.001，P＜0.05）。說明BSZG組可提高去勢(shì)大鼠血清SRC-3水平，優(yōu)于ALEN組。
　　2.3、補(bǔ)腎中藥復(fù)方對(duì)去勢(shì)大鼠SRC-3 mRNA表達(dá)的影響
　　OVX組、BSZG組及ALEN組的去勢(shì)大鼠股骨骨髓中SRC-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均低于Sham組(P＜0.05):但BSZG組的股骨骨髓中SRC-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平高于OVX組(P＜0.05)，而ALEN組與

21、OVX組無差別(P＞0.05)。說明BSZG組可提高去勢(shì)大鼠股骨骨髓中SRC-3 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，且效果優(yōu)于ALEN組。
　　結(jié)論:
　　在細(xì)胞水平闡述了MG63中表達(dá)SRC-3和PGC-1α，通過腺病毒介導(dǎo)SRC-3和PGC-1α雙基因聯(lián)合高表達(dá)，轉(zhuǎn)染MG63后，促進(jìn)了MG63增殖，激活了內(nèi)源性ERRα的基因表達(dá)及P38MAPK通路，提高了ALP活性以及成骨特異基因Runx2、Osteocalcin、Osterix