小鼠胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩研究：M受體去敏感化的時(shí)間依賴特點(diǎn)及2-APB和激光強(qiáng)度對(duì)鈣振蕩的影響.pdf

1、背景與目的：
　　副交感神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）可通過乙酰膽堿毒蕈堿受體（M受體，mAChRs）穩(wěn)定地激發(fā)胰腺腺泡細(xì)胞產(chǎn)生典型鈣振蕩（ACh-induced pancreatic acinar cell calcium oscillations，ACh-PACCOs）進(jìn)而促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞的胰液分泌功能。胞內(nèi)鈣振蕩的動(dòng)態(tài)變化可利用激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal mi

2、croscope，LSCM）或雙光子掃描共聚焦顯微鏡（two-photon laser scanning microscopy，TPLSM）實(shí)時(shí)記錄。本項(xiàng)目研究目的有三：一是以我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的典型ACh-PACCOs反應(yīng)模型為基礎(chǔ)，通過精心設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)方案，定量地研究小鼠胰腺腺泡細(xì)胞mAChRs被ACh激活后出現(xiàn)去敏感化的特點(diǎn)，以期對(duì)ACh-PACCOs有更全面的了解。二是在此基礎(chǔ)上，檢測(cè)藥物2-APB對(duì)ACh-PACCOs的影響。三

3、是檢測(cè)激光強(qiáng)度對(duì)ACh-PACCOs的影響，以期優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。
　　材料與方法：
　　1.小鼠胰腺腺泡細(xì)胞分離。4~6月齡昆明小鼠，經(jīng)乙醚麻醉，頸椎脫臼處死后迅速取出胰腺，用膠原酶液（150~200U/ml）處理后分離得到細(xì)胞懸液備用。
　　2. LSCM/TPLSM成像與灌流給藥記錄。取適量胰腺腺泡細(xì)胞懸液于載物盤上，待細(xì)胞貼壁后，避光負(fù)載鈣熒光染料Fluo-4-AM20 min；進(jìn)而利用LSCM或TPLSM的二維連

4、續(xù)掃描模式（XYT）記錄ACh-PACCOs；相關(guān)藥物的影響根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案的要求通過灌流給藥裝置或微量噴藥裝置適時(shí)給予。
　　3.數(shù)據(jù)的分析處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以自身對(duì)照為主，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（?X±S）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用兩樣本T檢驗(yàn)，多組比較時(shí)用單因素方差分析，曲線擬合用EXCEL軟件。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01認(rèn)為差異顯著。
　　結(jié)果與結(jié)論：
　　1.

5、mAChRs的去敏感化研究：ACh-PACCOs可通過動(dòng)態(tài)激光共聚焦鈣成像結(jié)合藥物灌流的方法實(shí)時(shí)直觀地記錄到，該反應(yīng)可被1?M的阿托品完全阻斷。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察到：如果延長(zhǎng)ACh的作用時(shí)間，其所誘發(fā)的PACCOs會(huì)逐漸減弱，說明mAChRs被ACh激活后會(huì)產(chǎn)生去敏感化；在不同濃度（50~800nM）ACh的作用下，胞內(nèi)產(chǎn)生的鈣信號(hào)隨ACh濃度的增高而增強(qiáng)，mAChRs去敏感化程度越明顯（此為與孫娜娜同學(xué)論文中共同研究結(jié)果）。定量研究

6、發(fā)現(xiàn)：在一定時(shí)間范圍（0~6min）內(nèi)，mAChRs去敏感化的恢復(fù)程度與間隔時(shí)間呈線性關(guān)系，這提示ACh激活的mAChRs去敏感化在撤去ACh的作用后可隨時(shí)間逐漸減弱，mAChRs活性逐漸恢復(fù)，具有線性的時(shí)間依賴特點(diǎn)。雙光子成像結(jié)合微量噴藥的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也得到類似的結(jié)論。
　　2.2-APB對(duì)ACh-PACCOs的影響：多種實(shí)驗(yàn)方案的結(jié)果都表明2-APB（10~100?M）可明顯改變ACh（100nM）-PACCOs的表現(xiàn)形式；統(tǒng)計(jì)發(fā)

7、現(xiàn)，2-APB在一定時(shí)間內(nèi)可使ACh-PACCOs的平均鈣釋放量明顯增大，頻率明顯降低，且這種效應(yīng)在一定范圍內(nèi)隨2-APB劑量增大而增強(qiáng)；但鈣釋放增強(qiáng)過后，細(xì)胞往往對(duì)ACh失去反應(yīng)能力，需過段時(shí)間才恢復(fù)。此現(xiàn)象可能與2-APB可阻斷鈣庫操縱性Ca2+內(nèi)流（store operated calcium entry，SOCE）有關(guān)。
　　3.激光強(qiáng)度對(duì)ACh-PACCOs的影響：結(jié)果顯示，與常用激光強(qiáng)度（一般3％）相比，加倍的激光強(qiáng)度