老年神經(jīng)退行性疾病與癌癥相關(guān)標(biāo)志物的表面等離子體激元共振與電化學(xué)研究.pdf

1、阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease，AD)由于患病率高、早期癥狀不明顯成為老年神經(jīng)退行性疾病中研究較多的一種。目前普遍認(rèn)為AD發(fā)病的主要原因是淀粉粥樣蛋白（amyloid-beta，Aβ）的產(chǎn)生和清除失衡。因此，Aβ及其相關(guān)蛋白的研究可為AD預(yù)防及治療提供重要信息。癌癥是另外一種威脅人類健康的重大疾病?；颊唧w液（如尿液、血液、唾液、腦脊液）中生物標(biāo)志物的濃度變化能反應(yīng)疾病的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。因此，疾病標(biāo)志物的檢測(cè)可為疾病

2、的預(yù)警、早期診斷以及后續(xù)治療提供重要依據(jù)。
　　表面等離子體激元共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是發(fā)生在金屬和電介質(zhì)界面的一種物理現(xiàn)象。通過(guò)檢測(cè)芯片表面折射率或厚度變化研究生物分子之間的相互作用。電化學(xué)技術(shù)通過(guò)檢測(cè)電極表面電活性物質(zhì)的氧化還原而實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)的定性及定量分析。電化學(xué)測(cè)定時(shí)需要電活性物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，而SPR檢測(cè)具有實(shí)時(shí)、免標(biāo)記的特點(diǎn)，兩種技術(shù)在一定程度上具有互補(bǔ)性。電化學(xué)與SPR都具有靈

3、敏度高、選擇性好、耗樣量少、并適于復(fù)雜體系分析等特點(diǎn)，在生命科學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　本文采用SPR與電化學(xué)方法對(duì)AD及膠質(zhì)瘤的重要標(biāo)志物進(jìn)行了定量及定性研究。具體工作如下:
　　1.采用雙通道SPR對(duì)AD的重要標(biāo)志物Aβ(1-42)及其結(jié)合蛋白TTR進(jìn)行了研究。將特異性捕獲腦脊液(CSF)中Aβ(1-42)和TTR的抗體分別固定在SPR兩個(gè)通道上，隨后流動(dòng)注射Aβ(1-42)與TTR標(biāo)準(zhǔn)溶液或腦脊液樣品與復(fù)合物(

4、由親和素和Aβ(1-16)抗體組成）的混合溶液并記錄SPR信號(hào)。該方法對(duì)Aβ(1-42)和TTR的檢測(cè)限分別為4.7pM和1.1nM。且二者在AD病人腦脊液中的濃度均低于健康人。兩種生物標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)為AD的預(yù)警及早期診斷提供了重要依據(jù)。此外，確定了CSF中Aβ(1-42)與TTR的作用形式。
　　2.采用可再生的Ni2+-NTA傳感芯片建立了連續(xù)篩選β-分泌酶(BACE1)抑制劑的SPR方法。抑制劑存在下BACE1的活性被抑制

5、，導(dǎo)致BACE1無(wú)法剪切芯片表面的多肽，此時(shí)流動(dòng)注射能識(shí)別多肽片段的抗體會(huì)產(chǎn)生較大的SPR信號(hào);當(dāng)BACE1的活性保持時(shí)，可被抗體識(shí)別的多肽片段被BACE1切割，導(dǎo)致抗體無(wú)法結(jié)合到芯片表面，結(jié)果觀察不到SPR信號(hào)。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、檢測(cè)通量高。通過(guò)該方法篩選出兩種潛在的BACE1抑制劑，其半抑制濃度(IC50)與酶聯(lián)免疫法(ELISA)和質(zhì)譜等結(jié)果一致。
　　3.利用二茂鐵覆蓋的納米金-親和素復(fù)合物進(jìn)行信號(hào)放大建立了電化學(xué)篩

6、選BACE1抑制劑的方法。當(dāng)BACE1的活性被抑制時(shí)，同樣觀察不到任何電化學(xué)信號(hào)。該方法可用于BACE1活性的檢測(cè)以及篩選BACE1抑制劑的研究。
　　4.通過(guò)納米金信號(hào)放大建立了靈敏檢測(cè)癌癥標(biāo)志物miRNA的電化學(xué)方法。生物素標(biāo)記的miRNA（與靶點(diǎn)miRNA具有相同的序列）與靶點(diǎn)miRNA和電極表面固定的DNA探針發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，隨后通過(guò)生物素與親和素的相互作用在電極表面引入二茂鐵覆蓋的納米金-親和素復(fù)合物。通過(guò)測(cè)定二茂鐵的電化