Srd1與Rim9蛋白在白念珠菌pH應(yīng)激反應(yīng)通路中的作用研究.pdf

1、白念珠菌(Candidaalbicans)是人類的條件致病性真菌，近年來，由于其感染率逐年上升而越來越受到人們的重視。白念珠菌致病的重要條件之一是其應(yīng)對外界環(huán)境變化的適應(yīng)能力。其中，最關(guān)鍵的是應(yīng)對生存環(huán)境pH變化的能力。在不同pH下白念珠菌的形態(tài)和毒力都各有不同，在酸性環(huán)境中以酵母態(tài)細(xì)胞生長，而在堿性環(huán)境中可由酵母態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂休^強(qiáng)致病力的菌絲態(tài)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Rim101p應(yīng)答途徑是白念珠菌參與pH調(diào)節(jié)的一條重要途徑，Rim9p是其中一員

2、，發(fā)揮輔助感受堿性刺激的作用。通過多蛋白序列比對，我們找到其同源基因SRD1/ORF19.1510,二者都屬于Sur7家族，具有相同的Sur7結(jié)構(gòu)域，因此，Srd1p是否也具有Rim9p類似的功能值得進(jìn)一步研究。
　　 目的:
　　 本文通過敲除SRD1基因并考察其功能，從而推測Srd1p是否與Rim9p蛋白功能相似，是否也參與Rim101p應(yīng)答通路組成。利用生物芯片技術(shù)以期從基因組和轉(zhuǎn)錄組水平闡明變異菌株對各類應(yīng)激敏感

3、性變化的機(jī)制。此外，考察His1-Leu2-Arg4基因敲除策略敲除白念珠菌基因時(shí)，異源性篩選標(biāo)記C.maltosa.LEU2，C.dubliniensisHIS1和C.dubliniensisARG4對菌株耐受各種刺激的表型影響。
　　 方法:
　　 用MAFFT網(wǎng)站進(jìn)行多蛋白序列比對。采用Hisl-Leu2-Arg4基因敲除策略構(gòu)建SRD1、RIM9單基因缺失菌。結(jié)合諾爾絲菌素抗性標(biāo)記及His1-Leu2-Arg4基

4、因敲除策略構(gòu)建SRD1、RIM9雙基因缺失菌，用麥芽糖培養(yǎng)基反篩去掉諾爾絲菌素抗性標(biāo)記。套式PCR法鑒定各菌的成功構(gòu)建。Spotassay實(shí)驗(yàn)考察各缺失菌對各刺激敏感性，包括pH刺激、氧化刺激、各種臨床抗菌藥刺激、金屬離子刺激、細(xì)胞壁損傷相關(guān)藥物刺激、滲透刺激和DNA損傷刺激。通過在10％胎牛血清，Spider及Lee's培養(yǎng)基中考察各缺失菌菌絲形成能力。利用微量液基稀釋法及抑菌曲線檢測變異菌CaLY188對唑類藥物的敏感性。通過FM4

5、-64染色后于激光共聚焦顯微鏡下觀察各缺失菌囊泡的形態(tài)。
　　 白念珠菌具有高適應(yīng)性的特點(diǎn)，而基因組的可塑性是其適應(yīng)壓力的一個(gè)重要策略。本研究采用生物芯片技術(shù)，綜合利用比較基因組學(xué)(CGH)及表達(dá)譜學(xué)研究手段，從基因組和轉(zhuǎn)錄組水平探討變異菌CaLY188對唑類敏感性降低及變異菌CaLY55對多種刺激敏感性升高的機(jī)制。采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行比較基因組芯片和表達(dá)譜芯片結(jié)果的驗(yàn)證。
　　 為考察異源性篩選標(biāo)記C.maltosa

6、LEU2，C.dubliniensisHIS1和C.dubliniensisARG4對菌株耐受各種刺激的影響，以SN152為親本菌，采用His1-Leu2-Arg4基因敲除策略分別構(gòu)建上述三個(gè)標(biāo)記的回復(fù)菌，套式PCR法鑒定回復(fù)菌的成功構(gòu)建，Spotassay實(shí)驗(yàn)考察菌株對各種刺激的敏感性。
　　 結(jié)果:
　　 經(jīng)套式PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定，各菌株構(gòu)建成功。Spotassay實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示C.a.SRD1基因敲除菌的所有

7、應(yīng)激相關(guān)表型與親本菌無差異，SRD1、RIM9雙缺失菌的表型基本與RIM9單缺失菌一致，包括堿性pH刺激、氯化鋰敏感性升高和菌絲形成缺陷。此外RIM9缺失菌還有一些文獻(xiàn)未報(bào)道過的表型，如對氟康唑、酮康唑、過氧化氫、羥基脲、熒光增白劑、剛果紅等敏感性降低及對兩性霉素B和氯化鈉敏感性略微升高等。Rim9p和Srd1p蛋白都不影響液泡的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　 在構(gòu)建SRD1基因的敲除菌時(shí)我們得到兩株變異菌，分別命名為CaLY55和CaLY1

8、88。CaLY55對考察的大部分刺激很敏感，比較基因組學(xué)表明，菌株中并未發(fā)生片段性染色體變異，發(fā)生拷貝數(shù)變異的基因也極為有限。表達(dá)譜學(xué)研究表明，菌株中有400個(gè)基因發(fā)生差異性表達(dá)，按GO分析主要涉及致病過程；應(yīng)答外界刺激過程；氧化還原過程；羧酸、酮酸及氨基酸代謝過程等。
　　 Spotassay實(shí)驗(yàn)、微量液基稀釋法和時(shí)間殺菌曲線法的結(jié)果都顯示CaLY188對唑類藥物的敏感性降低。比較基因組學(xué)表明，菌株中R染色體發(fā)生拷貝數(shù)變異，比

9、親本菌多了0.5倍，即由二倍體擴(kuò)增為三倍體。其SRD1基因回復(fù)菌CaLY350也有一致的耐藥表型，并且比較基因組學(xué)結(jié)果R染色體拷貝數(shù)同樣擴(kuò)增，與實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證結(jié)果相符，提示R染色體拷貝數(shù)擴(kuò)增與耐藥表型有一定相關(guān)性。CaLY188的表達(dá)譜學(xué)研究表明，菌株中250個(gè)基因發(fā)生差異性表達(dá)，按染色體分布，76個(gè)位于R染色體，占總數(shù)的30％，可能是由于基因組水平拷貝數(shù)增加引起的。
　　 PCR驗(yàn)證七種異源篩選標(biāo)記回復(fù)菌株構(gòu)建成功，Spo

10、tassay結(jié)果顯示各回復(fù)菌對pH刺激、氧化刺激、各種臨床抗菌藥刺激、金屬離子刺激、滲透刺激、DNA損傷劑刺激的敏感性與親本菌SN152一致。而給予0.02％SDS刺激時(shí)各菌株的敏感性不一致，缺乏C.d.HIS1標(biāo)記的菌株在0.02％SDS刺激下不能生長。
　　 結(jié)論:
　　 C.a.SRD1基因的敲除菌并沒有任何應(yīng)激相關(guān)表型。在SRD1和RIM9雙缺失菌中也不能增強(qiáng)RIM9缺失的效應(yīng)，發(fā)揮應(yīng)激和菌絲形成相關(guān)功能的是Ri

11、m9p，而不是Srd1p。Rim9p對菌絲形成能力方面的影響，不僅僅依賴于外界環(huán)境的堿性pH，在中性pH時(shí)也同樣發(fā)揮作用。
　　 CaLY55對眾多應(yīng)激條件敏感，但并不是由基因組拷貝數(shù)變化引起的。從轉(zhuǎn)錄組水平來看近50％差異性表達(dá)的基因可能涉及應(yīng)激應(yīng)答，使其在無外加刺激的營養(yǎng)豐富YPD培養(yǎng)基中便已處于“天然”應(yīng)激狀態(tài)，因此表現(xiàn)出對絕大多數(shù)外加刺激敏感性升高。5個(gè)菌絲形成抑制因子的高表達(dá)使其表現(xiàn)出菌絲形成能力明顯降低的現(xiàn)象。

12、>　　 CaLY188的耐藥表型主要是由基因組DNA水平發(fā)生染色體拷貝數(shù)變異引起的，通過使R染色體的擴(kuò)增提高麥角甾醇合成通路ERG25基因的表達(dá)導(dǎo)致對唑類藥物耐受。且這種耐藥表型是不依賴CDR1、CDR2和MDR1的。
　　 C.d.HIS1、C.m.LEU2和C.d.ARG4三個(gè)異源性篩選標(biāo)記不影響白念珠菌對大部分刺激的敏感性，不同標(biāo)記基因敲除菌間可以相互比較，且可以統(tǒng)一用SN152作為對照菌株。在考察SDS刺激時(shí)，所用篩選