白念珠菌高鐵還原酶FRP1基因及其與Rim101蛋白相互作用的研究.pdf

1、白念珠菌是念珠菌病原體中最常見的一種條件性致病菌，由白念珠菌引起的感染逐年增多，受到國內(nèi)外廣泛的重視。白念珠菌應(yīng)答的一個(gè)主要環(huán)境因素為細(xì)胞外的pH，這種應(yīng)答反應(yīng)是由保守的真菌信號傳導(dǎo)途徑RIM101途徑所控制，許多依賴pH表達(dá)的基因受轉(zhuǎn)錄因子Rim101蛋白所調(diào)控。從宿主中獲得鐵的能力對于白念珠菌的定居和存活是必需的。白念珠菌鐵獲得系統(tǒng)的調(diào)控對其生存和毒力非常重要，而細(xì)胞外的不同pH條件影響著鐵離子的生物可利用率，因此推測鐵獲得系統(tǒng)受轉(zhuǎn)

2、錄因子Rim101蛋白調(diào)控。 為了研究Rim101蛋白與鐵代謝基因的相互作用，本實(shí)驗(yàn)通過白念珠菌野生型、rim101-/-突變型及其回復(fù)突變型在不同pH和添加不同濃度的螯合劑BPS培養(yǎng)條件下的表型實(shí)驗(yàn)，確定了Rim101蛋白是白念珠菌在堿性鐵限制環(huán)境中生長所必需的。構(gòu)建了 LacZ報(bào)告基因與高鐵還原酶基因FRP1啟動子的融合質(zhì)粒pNK1000，將其轉(zhuǎn)化野生型和rim101-/-突變型白念珠菌細(xì)胞，測定在不同培養(yǎng)條件下β-半乳糖苷

3、酶活性，結(jié)果表明：鐵代謝基因．FRP1表達(dá)的堿性pH上調(diào)是由鐵饑餓造成的，同時(shí)說明Rim101蛋白能夠正向調(diào)控FRP1的表達(dá)。高鐵還原酶基因FRP1的Northern雜交結(jié)果也證明了上述分析的結(jié)論。 為了驗(yàn)證高鐵還原酶基因FRP1功能的重要性，利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了白念珠菌高鐵還原酶基因FRP1的缺失突變株．frp1-/-，通過在不同濃度螯合劑BPS培養(yǎng)條件下的表型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，frp1-/-突變株對鐵饑餓環(huán)境更敏

4、感，說明Frp1蛋白是一種在堿性條件下起作用的高鐵還原酶。同時(shí)對FRP1啟動子區(qū)進(jìn)行5’端缺失分析，構(gòu)建了一系列的缺失片斷與LacZ的融合結(jié)構(gòu)，初步分析表明FRP1基因啟動子的功能區(qū)幾乎覆蓋整個(gè)1kb的區(qū)域，-822～-437片斷缺失后 LacZ活性逐漸降低，說明該區(qū)域有促進(jìn)啟動子活性的元件，-437～-263之間可能有強(qiáng)烈抑制啟動子活性的元件存在；而從-263～-124的缺失幾乎使得LacZ活性完全喪失。這為進(jìn)一步研究FRP1基因的轉(zhuǎn)