利用定點突變分析白念珠菌依賴鐵基因frp1啟動子元件

1、生物工程學報ChinJBiotech2008August2524(8):13481353journals.im.ChineseJournalofBiotechnologyISSN10003061cjb@im.?2008InstituteofMicrobiologyCASAccepted:February272008Supptedby:theNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.305700

2、96)thePh.DProgramsFoundationofMinistryofEducationofChina(No.20070055011)theScientificResearchFoundationfReturnedScholarsMinistryofEducationofChina.Crespondingauth:MingchunLi.Tel:862223508506Fax:862223508800Email:lmchun68

3、@.cn國家自然科學基金(No.30570096)教育部博士點基金資助項目(No.20070055011)教育部留學回國人員科研啟動基金(教外司留(2005)546號)資助。研究報告利用定點突變分析白念珠菌依賴鐵基因FRP1啟動子元件桂磊梁勇魏東盛鄭雯邢來君李明春南開大學微生物學系分子微生物學與技術教育部重點實驗室天津300071摘要:通過對白念珠菌高鐵還原酶基因FRP1啟動子進行突變分析確認啟動子中特殊調(diào)控元件。我們通過分析FRP1起

4、始密碼子上游1000bp序列發(fā)現(xiàn)在?160和?650處有2個推測的Rim101p結合位點對其分別進行定點突變?nèi)缓髽嫿▎幼优c報告基因LacZ融合質(zhì)粒轉化整合到白念珠菌rim101株和野生株中檢測不同缺鐵條件下?半乳糖苷酶活性。結果發(fā)現(xiàn)堿性條件Rim101p能夠正向調(diào)控FRP1的表達啟動子?160處突變對啟動子功能影響較弱而?650突變使啟動子活性大大降低此結果和雙突變的結果相同表明Rim101p主要通過與啟動子?650處結合位點相互作用

5、來調(diào)控FRP1的表達。關鍵詞:定點突變白念珠菌Rim101蛋白高鐵還原酶基因RegulatingPromoterElementofIrondependentGeneFRP1inCidaalbicansbySitedirectedMutationLeiGuiYongLiangDongshengWeiWenZhengLaijunXingMingchunLiKeyLabatyofMolecularMicrobiologyTechnologyM

6、inistryofEducationDepartmentofMicrobiologyNankaiUniversityTianjin300071ChinaAbstract:Microarrayanalysisrevealedthattheexpressionofferricreductase(FRP1)canberegulatedbytheRim101protein.Indertofindnewtranionalregulatyeleme

7、ntinthepromoterofFRP1weanalyzedthe1000bpsequenceupstreamofATGtofind2potentialRim101pbindingsites.WegeneratedsitespecificmutationsineachofthetwositesfusedthesemutatedpromoterstoLacZ.ThenthepromoterLacZfusionconstructwasre

8、combinantintowildtyperim101strainsf?galactosidaseassay.TheresultsrevealedthattheFRP1wasupregulatedinalkalinepHthiswascausedbyironstarvation.The?650sitenotthe?160sitehadanimptantroleinFRP1Rim101pdependentexpression.Weconc

9、ludethatRim101pmayinteractwiththe?650bindingsiteofthepromotertoregulatetheFRP1expression.Keywds:sitedirectedmutationCidaalbicansRim101proteinferricreductasegene鐵是生物必需的重要營養(yǎng)元素鐵離子是許多生化途徑例如呼吸作用三羧酸循環(huán)DNA和氨基酸的合成等過程中酶的輔助因子在自然界中生

10、物體可直接吸收利用的鐵非常有限因此微生物在長期的進化過程中形成高親和的鐵吸收系統(tǒng)來滿足細胞鐵離子需要。真菌中高親和吸收系統(tǒng)在釀酒1350ISSN10003061CN111998QChinJBiotechAugust252008Vol.24No.8Journals.im.變位點的引物E160mut和E160反mut以FRP1啟動子為模板分別用P1、E160mut和P2、E160反mutpfu酶PCR獲得帶有突變的兩端片段DNA回收試劑盒回

11、收純化后以這2條片段(比例1:1)為模板P1和P2為引物PCR獲得1條1000bp的DNA條帶即為突變完成的啟動子PFRP1160mut。PFRP1650mut和PFRP1160650mut突變方法同上。1.6?半乳糖苷酶活性的測定將轉化子接種于35mLTC199培養(yǎng)基中30oC振蕩培養(yǎng)至OD600≈1.0時收集菌體?半乳糖苷酶活性的測定見文獻[9]?半乳糖苷酶的活性計算公式OD400(顏色)1000[OD600(菌濃)t(min)3(