達盧生坦外消旋體的手性拆分及其體內(nèi)外代謝研究.pdf

1、達盧生坦(darusentan, LU135252)化學(xué)名為(+)-(S)-2-[(4，6-二甲氧基嘧啶)-2-氧基]-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸，為選擇性內(nèi)皮素受體拮抗劑，單獨用藥可顯著降低Ⅱ級高血壓患者的血壓，與其他降壓藥物聯(lián)用可有效降低頑固性高血壓患者的血壓。目前達盧生坦外消旋體的手性拆分未見報道，為了實現(xiàn)對達盧生坦的質(zhì)量控制，本研究首次使用ES-OVM柱對達盧生坦外消旋體進行手性拆分和含量測定。
　　 藥物的生物轉(zhuǎn)化

2、又稱為藥物代謝，本研究從體外代謝入手，進行大鼠肝微粒體溫孵、微生物轉(zhuǎn)化，腸內(nèi)菌厭氧培養(yǎng)，模擬體內(nèi)代謝過程，并盡可能的制備轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)具有專屬、快速、靈敏等優(yōu)點，是混合物中化學(xué)成分定性和定量分析的有力工具。本研究即采用HPLC-MS技術(shù)，對大鼠尿液、糞便、膽汁、血漿和組織中的代謝物進行分析，并對其結(jié)構(gòu)和代謝途徑進行推斷。
　　 第一部分、達盧生坦外消旋體的HPLC法手性拆分及含量測定
　

3、　 目的：建立HPLC法拆分外消旋達盧生坦對映體，并進行含量測定。
　　 方法：采用ES-OVM柱(4.6mm×150mm，5μm)，以30mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH3.35)-乙腈(60∶40)為流動相，流速0.8ml/min，柱溫20℃，檢測波長248nm。
　　 結(jié)果：建立了拆分外消旋達盧生坦對映體的HPLC方法，并進行了含量測定。達盧生坦及其(R)-異構(gòu)體均在0.01～0.10mg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良

4、好。平均回收率為99.6％和99.5％，RSD為0.75％和0.82％。最低檢測限1ng。
　　 第二部分、達盧生坦體外代謝研究
　　 目的：通過模擬體內(nèi)代謝過程的離體實驗研究達盧生坦的體外代謝。應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)化、腸道菌厭氧培養(yǎng)、肝微粒體溫孵等多種方法尋找達盧生坦的代謝物，并盡可能的制備轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
　　 方法：(1)微生物轉(zhuǎn)化實驗：HPLC法從12種真菌中篩選出對達盧生坦有轉(zhuǎn)化能力的菌株，色譜條件：反相C18柱，流

5、動相為A(甲醇)-B(0.025％甲酸水)，梯度洗脫：0-25min，10％A～70％A;25-55min，70％A～86％A;55-60min，86％A～98％A;60-70min，98％A;后運行8min。柱溫為25℃，流速為1ml/min。分離制備代謝物，并對代謝物通過電噴霧離子源正離子和負離子模式進行一級質(zhì)譜掃描、子離子掃描，對其結(jié)構(gòu)進行推斷。(2)腸道菌培養(yǎng)：取大鼠糞便，利用文獻報道腸道菌厭氧培養(yǎng)的方法，研究達盧生坦的代謝。(

6、3)肝微粒溫孵實驗：根據(jù)文獻報道的方法將達盧生坦加入微粒體溫孵液中，溫孵一定時間后，處理樣品并采用HPLC-DAD和多離子反應(yīng)監(jiān)測-信息依賴-增強型子離子掃描(MRM-IDA-EPI)模式分析體內(nèi)代謝生物樣品。根據(jù)產(chǎn)生的碎片離子信息推測化合物的結(jié)構(gòu)。色譜條件：反相C18柱，流動相為A(含0.05％甲酸的甲醇)-B(0.05％甲酸水)梯度洗脫：0-5min,20％A～60％A;5-20min,60％A～95％A;20-34min,95％A

7、;34-35min，95％A～20％A;后運行8min，20％A。柱溫30℃，流速為0.8ml/min。質(zhì)譜條件：ESI源，源電壓5500V，正離子檢測，源溫度(TEM)650℃，霧化氣(gas1)60 psi，加熱氣(gas2)65 psi，簾氣25 psi。
　　 結(jié)果：(1)微生物轉(zhuǎn)化試驗：經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleana, AS3.970)對達盧生坦有代謝能力，重現(xiàn)性好但轉(zhuǎn)化

8、率低，無法大量制備，由一級質(zhì)譜掃描、子離子掃描推測該代謝物為達盧生坦的六碳糖結(jié)合物。(2)經(jīng)多次試驗，從腸道菌培養(yǎng)液中沒有發(fā)現(xiàn)明顯代謝物。(3)肝微粒體溫孵試驗：在SD大鼠和Wistar大鼠肝微粒體溫孵液中發(fā)現(xiàn)了達盧生坦代謝物，兩種屬大鼠代謝物沒有明顯差異，由HPLC-MS/MS法推測了代謝物結(jié)構(gòu)為2-[(4，6-二甲氧基嘧啶)-2-氧基]-3-羥基-3，3-二苯基丙酸。
　　 結(jié)論：通過微生物轉(zhuǎn)化法和肝微粒體溫孵試驗各發(fā)現(xiàn)達盧

9、生坦一個代謝產(chǎn)物，并分別推測了代謝物的結(jié)構(gòu)。由于微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)率較低，體外代謝試驗未能制備得到達盧生坦代謝物。
　　 第三部分、達盧生坦體內(nèi)代謝研究
　　 目的：確認達盧生坦的電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律，建立靈敏、有效的液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS/MS)分析方法，尋找達盧生坦在大鼠體內(nèi)代謝物，并推測代謝物的結(jié)構(gòu)和代謝途徑。
　　 方法：以SD大鼠為對象，收集以達盧生坦灌胃后尿、糞便、血漿、膽汁、小腸、胃、肝、肺、腎、脾、心等生物

10、樣品。通過電噴霧離子源正離子和負離子模式進行一級質(zhì)譜掃描、子離子掃描和母離子掃描，研究達盧生坦對照品的質(zhì)譜裂解途徑和規(guī)律，進而聯(lián)合采用母離子掃描-信息依賴-增強型子離子掃描(PREC-IDA-EPI)和多離子反應(yīng)監(jiān)測-信息依賴-增強型子離子掃描(MRM-IDA-EPI)兩種模式分析體內(nèi)代謝生物樣品。根據(jù)兩種模式產(chǎn)生的碎片離子信息確定化合物的結(jié)構(gòu)。色譜條件：Waters Symmetry C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動相

11、為A(含0.05％甲酸的甲醇)-B(0.05％甲酸水)梯度洗脫：0-5min，20％A～60％A;5-20min，60％A～95％A;20-34min，95％A;34-35min，95％A～20％A;后運行8min，20％A;柱溫30℃，流速為0.8ml/min，進樣量10μl。質(zhì)譜條件：ESI源，源電壓5500V，正離子檢測，源溫度(TEM)650℃，霧化氣(gas1)60 psi，加熱氣(gas2)65 psi，簾氣25 psi。<

12、br>　　 結(jié)果：闡明了達盧生坦的質(zhì)譜裂解規(guī)律，據(jù)此推測達盧生坦在大鼠體內(nèi)的10種代謝產(chǎn)物。體內(nèi)生物樣品中除脾和心中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的代謝物外，尿樣、糞便、膽汁、血樣、胃、小腸、肝、腎、肺均有所發(fā)現(xiàn)。
　　 結(jié)論：達盧生坦在大鼠體內(nèi)發(fā)生生物轉(zhuǎn)化，在膽汁中能檢測到10個代謝物，尿樣中也有6個明顯的代謝物，達盧生坦的主要代謝場所是肝臟，膽汁和尿是達盧生坦代謝物的重要排泄途徑。本法靈敏、準確，能用于達盧生坦代謝物的檢測和結(jié)構(gòu)推測，PRE