中藥中黃酮類化合物全定性分析策略.pdf

1、中藥是中華民族經(jīng)歷漫長(zhǎng)歷史而保存下來的民族瑰寶。20年前我國(guó)提出了中藥現(xiàn)代化的口號(hào)，但因諸多原因，中藥現(xiàn)代化之路并不順暢。中藥為眾多化合物組成的復(fù)雜混合物，其藥效為眾多化合物的整體協(xié)同作用結(jié)果，僅僅分離并鑒定出幾個(gè)常量成分并測(cè)定其生物活性不能真正闡明中藥的藥效基礎(chǔ)。在本論文中，我們?cè)噲D建立系列能對(duì)中藥中的次生代謝產(chǎn)物黃酮(包括常量與微量組分)進(jìn)行全定性分析的策略，以求更為確切地闡明相關(guān)中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而有效地為其藥效研究及質(zhì)量控制提供

2、依據(jù)。
　　 在中藥化學(xué)成分研究中，除了采用傳統(tǒng)的植化分離方法外，基于聯(lián)用技術(shù)發(fā)展起來的在線鑒定方法已得到廣泛應(yīng)用。兩類方法比較而言，各有其優(yōu)缺點(diǎn)：傳統(tǒng)植化分離過程繁瑣，且對(duì)于微量、不穩(wěn)定及難分離物質(zhì)的分離存在很大困難，但使用該方法得到的單體化合物能進(jìn)行全面的波譜及理化性質(zhì)表征，結(jié)構(gòu)鑒定確切；在線鑒定方法簡(jiǎn)單、快速，且適合于微量甚至痕量化合物及不穩(wěn)定和難分離組分的分析，但獲得的結(jié)構(gòu)信息常不全面。因此本論文的核心思路為利用傳統(tǒng)植化

3、分離技術(shù)與在線鑒定技術(shù)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)性，采取相應(yīng)措施，探討實(shí)現(xiàn)中藥活性成分的全定性分析的新方法。針對(duì)中藥樣品的實(shí)際情況，設(shè)計(jì)了兩種全定性分析方案，分別用于化學(xué)物質(zhì)背景不明確的中藥樣品(方案一)和化學(xué)物質(zhì)背景較明確的中藥樣品(方案二)。本論文的主要目的為在以上思路的指引下，實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥黃芩根、黃芩莖葉及藏藥唐古特青蘭中的黃酮類化合物的全定性分析。具體內(nèi)容包括以下五個(gè)方面。
　　 ⑴基于乙腈/水體系加少量氯仿等疏水有機(jī)溶劑能誘導(dǎo)分相的現(xiàn)象

4、，建立了一種中藥中的黃酮類化合物提取分離的新方法：溶劑誘導(dǎo)相變萃取(solvent induced phase transition extraction，SIPTE)法。該方法集提取與分離于同一過程，能夠?qū)⒅兴幹械狞S酮類成分按苷元與糖苷徹底地分成兩部分，從而顯著簡(jiǎn)化后續(xù)的精制過程。該方法為本論文所要建立的中藥中黃酮類化合物的全定性分析策略奠定了重要分離技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 ⑵在提出的中藥活性成分全定性分析思路，“方案一”，的指導(dǎo)下

5、，對(duì)重要中藥黃芩根的黃酮類成分進(jìn)行了準(zhǔn)確的全定性分析。具體實(shí)施如下：第一步，HPLC-UV/MS分析，共有32個(gè)組分被檢測(cè)且均被確定為黃酮類化合物；第二步，結(jié)合所建立的SIPTE法和傳統(tǒng)柱層析法對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)分離，獲得18個(gè)常量組分的單體化合物，并進(jìn)行波譜表征以確定結(jié)構(gòu)；第三步，系統(tǒng)地研究各分離單體化合物的MS及UV行為；第四步，基于在線獲得的UV及MS(MSn)數(shù)據(jù)對(duì)未得到單體化合物的13個(gè)微含量組分進(jìn)行在線結(jié)構(gòu)鑒定，從而最終實(shí)現(xiàn)黃酮根

6、中黃酮類化合物的全定性分析。該工作在方法學(xué)上驗(yàn)證了我們所提出的中藥活性成分全定性分析思路的實(shí)際可行性，而黃岑根中黃酮類化合物的全定性分析結(jié)果為更全面地闡明中藥黃芩根的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了強(qiáng)有力的支持，對(duì)黃芩根及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制、安全評(píng)價(jià)、藥效研究以及新產(chǎn)品的研發(fā)有著重要意義。
　　 ⑶在所提出的中藥活性成分全定性分析思路，“方案二”。的指導(dǎo)下繼續(xù)對(duì)黃芩莖葉內(nèi)黃酮類成分進(jìn)行準(zhǔn)確的全定性分析。具體實(shí)施如下：第一步，同樣為HPLC-UV/

7、MS分析，共有21個(gè)成分被檢測(cè)并確定為黃酮類化合物，其中絕大部分為黃芩莖葉獨(dú)有成分；第二步，根據(jù)上一章工作總結(jié)的各黃酮類化合物的UV特征及MS裂解規(guī)律，并參考大量文獻(xiàn)，對(duì)黃芩莖葉內(nèi)黃酮類化合物進(jìn)行在線鑒定。共有17個(gè)組分結(jié)構(gòu)得以成功鑒定；第三步，對(duì)另外4個(gè)無法在線鑒定的組分進(jìn)行目標(biāo)性分離制備和結(jié)構(gòu)鑒定，從而最終實(shí)現(xiàn)了對(duì)黃芩莖葉內(nèi)黃酮類組分的全定性分析，其中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新化合物。在上一章工作的基礎(chǔ)上，此工作還對(duì)黃芩莖葉中黃酮類化合物的MS及U

8、V行為進(jìn)行了補(bǔ)充研究，著重研究了二氫黃酮類化合物的MS及UV特征。本工作進(jìn)一步驗(yàn)證了我們所提出的中藥活性成分全定性分析思路的可行性，所得到的全定性分析結(jié)果對(duì)黃芩莖葉及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制及新產(chǎn)品的研發(fā)有著重要意義。
　　 ⑷為更進(jìn)一步考察全定性分析策略的可行性，采用“方案一”對(duì)藏藥唐古特青蘭中黃酮類化合物進(jìn)行全定性分析。即第一步分析，第二步系統(tǒng)分離，第三步總結(jié)歸納各化合物UV及MS特征，第四步對(duì)難分離組分進(jìn)行在線鑒定?？偣灿?個(gè)

9、組分被檢測(cè)并確定為黃酮類化合物，其中6個(gè)成分被分離純化并通過波譜表征以確定結(jié)構(gòu)，2個(gè)難分離組分得以成功在線鑒定。所鑒定的8個(gè)黃酮類化合物均為首次從唐古特青蘭中報(bào)道。
　　 ⑸鑒于傳統(tǒng)的MSn結(jié)構(gòu)鑒定方法尚不能確定黃酮類化合物取代基的具體取代位點(diǎn)，為此，本文建立了一種新的能精確確定黃酮類化合物羥基取代位點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定方法。在正ESI模式下，黃酮苷元分子離子產(chǎn)生系列C環(huán)裂解的i,jA+與i,jB+特征離子，這些離子較原苷元離子簡(jiǎn)單得多

10、，且保存了完整的原黃酮苷元的A環(huán)或B環(huán)結(jié)構(gòu)。我們以i,jA+及i,jB+離子的下一級(jí)CAD裂解對(duì)原黃酮化合物的A環(huán)和B環(huán)的具體結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行鑒定。研究表明：所有類型黃酮類化合物的A環(huán)結(jié)構(gòu)都可以通過1,3A+離子的下一級(jí)CAD裂解得以鑒定；黃酮類化合物的B環(huán)結(jié)構(gòu)可以通過1,3B+離子的下一級(jí)CAD裂解得以鑒定；黃酮醇化合物的B環(huán)結(jié)構(gòu)可以通過0,2B+離子的下一級(jí)CAD裂解得以鑒定。該工作進(jìn)一步完善我們所建立的中藥中黃酮類化合物全定性分析策略