感覺神經(jīng)肽受體在幼年哮喘氣道重塑大鼠中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、支氣管哮喘是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅公眾健康的慢性疾病,氣道炎癥和氣道重塑是其兩個(gè)主要病理學(xué)特征。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為哮喘的氣道重塑是對(duì)反復(fù)炎癥損傷的反應(yīng),最終導(dǎo)致結(jié)構(gòu)改變,即氣道重塑是由炎癥刺激物持續(xù)存在引起的。但氣道重塑的分子機(jī)制及是否可以真正逆轉(zhuǎn)尚不清楚,目前也缺乏用以評(píng)價(jià)氣道重塑的指標(biāo)和干預(yù)措施,氣道重塑的機(jī)制及治療已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)、外研究的重點(diǎn)。
　　 氣道的神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)除了經(jīng)典的腎上腺素能和膽堿能神經(jīng)外,還存在一種非腎上腺素能非膽堿

2、能(nonadrenergie noncholinergic,NANC)神經(jīng)系統(tǒng),感覺神經(jīng)肽是其重要的神經(jīng)遞質(zhì)。目前認(rèn)為與哮喘關(guān)系較為密切的感覺神經(jīng)肽有P物質(zhì)(Substance P,SP)、神經(jīng)激肽A(Neurokinin A,NKA)、神經(jīng)激肽B(NeurokininB,NKB),通過相應(yīng)的NK-1R、NK-2R、NK-3R等受體發(fā)揮作用。尚云曉等研究表明,感覺神經(jīng)肽(NKA、NKB、SP)與小兒哮喘的發(fā)作及緩解關(guān)系極為密切,激素治

3、療有顯著降低哮喘患兒血及支氣管誘導(dǎo)痰液中上述感覺神經(jīng)肽的作用,而且發(fā)現(xiàn)豚鼠哮喘模型急性期的支氣管中NK-1R表達(dá)增多。但感覺神經(jīng)肽受體在哮喘氣道重塑各階段的表達(dá)尚少見報(bào)道。
　　 在受到傷害性刺激時(shí),SP可逆向釋放入損傷局部組織中,參與對(duì)修復(fù)細(xì)胞增殖、遷移、分化的調(diào)控,有研究表明,SP可促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮干細(xì)胞等細(xì)胞的增殖、遷移。目前認(rèn)為,平滑肌的變化是氣道重塑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過SP刺激后,氣管平滑肌細(xì)胞

4、(airway smooth muscle cell,ASMC)DNA合成顯著增加,表明SP可以促進(jìn)ASMC的增殖,但在ASMC的遷移、合成分泌中SP及其受體的作用尚未見報(bào)道。
　　 細(xì)胞骨架由微絲、微管及中等纖維組成,三者高度協(xié)調(diào)分布,與胞核、質(zhì)膜、細(xì)胞器相連,構(gòu)成了細(xì)胞形態(tài)骨架和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)系統(tǒng),以此維持細(xì)胞的特定形狀和細(xì)胞內(nèi)多種成分的空間位置,近年來的研究進(jìn)一步證實(shí),細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)還廣泛參與細(xì)胞增殖、分泌、運(yùn)動(dòng)、粘連、信號(hào)傳

5、遞、分化等與生命現(xiàn)象相關(guān)的活動(dòng)過程,并且在許多疾病中有過表達(dá)現(xiàn)象。但是目前卻鮮有從細(xì)胞骨架方面去研究哮喘氣道重塑的發(fā)生機(jī)制的研究。
　　 有研究表明,小G蛋白家族中RhoA/ROCK信號(hào)途徑參與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控,故受到廣泛重視。近年來的研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK信號(hào)通路參與哮喘發(fā)病的眾多病理生理過程,例如參與哮喘氣道高反應(yīng)性(Airwayhigh reactivity,AHR)的形成、嗜酸性粒細(xì)胞向氣道趨化

6、聚集、氣道重塑等。然而RhoA/ROCK信號(hào)途徑在哮喘氣道重塑ASMC中微管骨架重構(gòu)中的作用則少見報(bào)道。
　　 目的：
　　 本研究應(yīng)用卵蛋白(Ovalbumin,OVA)對(duì)SD大鼠進(jìn)行2w、4w、6w、8w不同時(shí)間的激發(fā),建立哮喘氣道重塑動(dòng)物模型,并原代培養(yǎng)SD大鼠氣管平滑肌細(xì)胞,探討感覺神經(jīng)肽受體在哮喘氣道重塑中的表達(dá)、作用及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制,為尋求哮喘氣道重塑的防治提供新思路。
　　 材料與方法：

7、　　 1、SD大鼠哮喘氣道重塑模型的建立:體重60～80g幼年SD大鼠隨機(jī)分組,按OVA激發(fā)時(shí)間的不同分為哮喘組(2w、4w、6w、8w)及同期對(duì)照組(2w、4w、6w、8w)和布地奈德組(8w)、孟魯斯特組(8w),每組8只。哮喘組于第1天與第8天腹腔注射抗原致敏液1ml,從第15天開始,以1％OVA超聲霧化吸入,每次30min,每周3次,持續(xù)時(shí)間分別為2w、4w、6w、8w。對(duì)照組應(yīng)用生理鹽水代替致敏液和OVA。布地奈德組:每次激

8、發(fā)前30min,給予布地奈德混懸液2.5mg/Kg,加生理鹽水至2ml,放入百瑞PRONEB壓縮吸入機(jī)驅(qū)動(dòng)霧化吸入,共8w。孟魯斯特組:每次激發(fā)前2h,給予孟魯斯特15mg/kg灌胃,共8w。
　　 2、標(biāo)本采集與保存:每組大鼠于末次激發(fā)24h內(nèi)腹腔注射1％戊巴比妥鈉麻醉,進(jìn)行左肺肺泡灌洗。右肺中葉置于4％多聚甲醛用于HE染色和免疫組化染色。剩余氣管及肺組織-80℃冰箱保存用于抽提總RNA、抽提蛋白及羥脯氨酸測(cè)定。
　　

9、 3、支氣管病理學(xué)觀察:HE染色,圖像分析測(cè)定支氣管基底膜周徑(Pbm)、總管壁面積(Wat)及平滑肌面積(Wam)。
　　 4、大鼠氣管平滑肌細(xì)胞(ASMC)的原代培養(yǎng):用酶消化法原代培養(yǎng),差速貼壁法純化細(xì)胞,第3～5代的ASMC用于實(shí)驗(yàn)。
　　 5、四甲基偶氮唑藍(lán)顯色法(MTT):檢測(cè)ASMC增殖。
　　 6、transwell小室:檢測(cè)ASMC遷移。
　　 7、免疫化學(xué)染色:檢測(cè)支氣管NK-IR的表

10、達(dá)和ASMC中Ⅲ型膠原的表達(dá)。
　　 8、免疫熒光染色:檢測(cè)ASMC中NK-1R、F-actin、α-tubulin的表達(dá)。
　　 9、real time quantitative PCR-檢測(cè)NK-1R、NK-2R、RhoA、ROCK的mRNA。
　　 10、Western blot:檢測(cè)NK-IR、NK-2R、α-tubulin、RhoA、ROCK的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、OVA激

11、發(fā)時(shí)可見到大鼠咳嗽、呼吸困難、喘息,哮喘各組支氣管肺泡灌洗液(BALF)q～白細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸粒細(xì)胞百分比較對(duì)照組大鼠明顯增加,哮喘2w組即出現(xiàn)氣道壁及氣道平滑肌厚度增加,羥脯氨酸含量增高,尤以哮喘8w組表現(xiàn)最為明顯。布地奈德組和孟魯斯特組BALF中白細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞含量較哮喘8w組明顯下降,并能顯著抑制氣道壁平滑肌的增厚、膠原沉積,但與對(duì)照組比較,氣道重塑病理表現(xiàn)仍較顯著。
　　 2、哮喘各組較同期對(duì)照組氣管NK-1R、NK-2

12、R的mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.01),且隨抗原激發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng),NK-1R、NK-2R的表達(dá)增加更明顯。布地奈德組和孟魯斯特組NK-1R、NK-2R的mRNA和蛋白表達(dá)較哮喘組減少(P＜0.05),但高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　 3、ASMC中NK-1R、NK-2R的mRNA及蛋白表達(dá)與氣管組織中的趨勢(shì)相同,哮喘各組ASMC中NK-1R、NK-2R的mRNA、蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組,以8w組最高(P＜0.01).NK

13、-1R主要分布在ASMC的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。
　　 4、哮喘組大鼠的ASMC與對(duì)照組比較細(xì)胞增殖顯著增快。MTT法測(cè)得各時(shí)間點(diǎn)的哮喘組ASMC的平均A值均高于對(duì)照組,差異有顯著性(P＜0.05)。NK-1R特異性拮抗劑WIN62577對(duì)ASMC的增殖有抑制作用,呈劑量依賴性,WIN6257710-8mol/L組抑制作用最強(qiáng)。
　　 5、哮喘2w、4w、6w、8w組ASMC遷移細(xì)胞數(shù)目較對(duì)照組明顯增多,NK-1R拮抗劑組細(xì)胞

14、遷移數(shù)目較哮喘8w組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).
　　 6、ASMC中Ⅲ型膠原免疫化學(xué)染色顯示,棕黃色的Ⅲ型膠原陽性顆粒主要分布在胞漿.哮喘2w、4w、6w、8w組Ⅲ型膠原平均灰度值均高于對(duì)照組,以8w組為最顯著。NK-1R阻斷后,Ⅲ型膠原平均灰度值明顯低于未阻斷的哮喘平均灰度值,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 7、免疫熒光染色顯示,哮喘氣道重塑組細(xì)胞應(yīng)力纖維形成增多,F-actin平均灰度值高

15、于對(duì)照組;加入NK-1R特異拮抗劑WIN62577或ROCK特異抑制劑Y27632預(yù)處理后,應(yīng)力纖維少見,F-actin平均灰度值減低。
　　 8、α-tubulin免疫熒光染色顯示,α-tubulin綠色熒光在ASMC胞質(zhì)內(nèi)呈高密度絲網(wǎng)狀、放射樣由細(xì)胞核中心向周邊分布。哮喘氣道重塑組ASMC中α-tubulin的蛋白表達(dá)顯著增加,給予NK-1R拮抗劑WIN62577或ROCK.特異抑制劑Y27632預(yù)處理哮喘氣道重塑大鼠ASM

16、C,則α-tubulin的表達(dá)下降。
　　 9、哮喘氣道重塑組RhoA、ROCK的mRNA及蛋白的表達(dá)顯著增加,NK-1R拮抗劑預(yù)處理哮喘氣道重塑大鼠ASMC,則RhoA、ROCK的mRNA及蛋白的水平下降。
　　 結(jié)論：
　　 1、隨抗原激發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)哮喘組NK-1R、NK-2R的表達(dá)也增加,哮喘組對(duì)感覺神經(jīng)肽的敏感性增高,感覺神經(jīng)肽受體在哮喘氣道重塑的發(fā)生中起著重要的作用。
　　 2、感覺神經(jīng)肽受體的