胸腺免疫抑制五肽TIPP的抗哮喘氣道炎癥作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　哮喘是由多種細(xì)胞（包括氣道的炎癥和結(jié)構(gòu)細(xì)胞）和炎癥介質(zhì)參與的氣道慢性炎癥性疾病，氣道炎癥是其發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)和核心。哮喘患病率高，在各個(gè)年齡階段的人群均可發(fā)病，已成為全球關(guān)注的公眾衛(wèi)生問題。哮喘不能根治，只能通過藥物進(jìn)行控制?，F(xiàn)在治療哮喘最常用的藥物是糖皮質(zhì)激素，對(duì)于嚴(yán)重哮喘患者長期吸入激素會(huì)產(chǎn)生局部或全身毒副反應(yīng)，因此研究開發(fā)治療效果好、毒副作用小的抗哮喘藥具有重要意義。
　　本項(xiàng)目組長期從事胸腺來源的免疫抑制組

2、分——胸腺免疫抑制提取物(TISE)的研究。TISE是內(nèi)源性的淋巴細(xì)胞生長抑制物，在體內(nèi)外均可以有效地抑制免疫反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)。研究表明TISE能顯著抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)和大鼠被動(dòng)皮膚過敏反應(yīng)，顯著延長大鼠移植皮膚的存活期，并對(duì)OVA刺激致敏豚鼠哮喘的發(fā)生有顯著的抑制作用。將低分子量的TISE通過微球菌核酸酶降解、酸水解及反相高效液相色譜分離相結(jié)合的方法進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，最終得到一個(gè)分子量為604.68 Da的五肽，其序列為Ala-

3、Glu-Trp-Cys-Pro，并將其命名為胸腺免疫抑制五肽(thymic immunosuppressive pentapeptide，TIPP)。鑒于TISE體內(nèi)外均有顯著的抗炎抗變態(tài)反應(yīng)的作用，TIPP是由TISE中分離純化得到的，我們推測(cè)TIPP可能也具有抗過敏和抗變態(tài)反應(yīng)炎癥的作用，并能用于哮喘的治療。為證實(shí)這個(gè)推測(cè)，我們首先對(duì)TIPP體內(nèi)抗哮喘氣道炎癥活性進(jìn)行研究，從組織水平、細(xì)胞水平、分子水平等各個(gè)方面評(píng)價(jià)TIPP對(duì)哮喘動(dòng)

4、物模型的治療作用及毒副作用;利用體外肥大細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TIPP的體外抗過敏活性及作用機(jī)制，結(jié)合蛋白芯片實(shí)驗(yàn)尋找相關(guān)的TIPP作用蛋白;因TIPP是一新發(fā)現(xiàn)的具有全新序列的五肽，對(duì)TIPP活性及其結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系進(jìn)行初步考察。本研究有可能發(fā)現(xiàn)一個(gè)治療過敏性疾病的新機(jī)制，并為TIPP這一新的五肽的深入開發(fā)奠定基礎(chǔ)，因此本項(xiàng)目研究具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：
　　1.TIPP體外免疫抑制活性及TIPP結(jié)構(gòu)與活性

5、關(guān)系的研究
　　首先用脾淋巴細(xì)胞檢測(cè)TIPP的細(xì)胞毒性、TIPP對(duì)不同絲裂原刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用及TIPP對(duì)LPS刺激的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響，并對(duì)TIPP與3種衍生物(D-Glu2)-TIPP、[Ala(Ac)1]-TIPP及(Ser4)-TIPP的免疫抑制活性進(jìn)行比較。
　　2.TIPP體內(nèi)抗哮喘氣道炎癥作用研究
　　采用五周齡雌性BALB/c小鼠于第0、7、14天進(jìn)行卵清蛋白(OVA

6、)致敏并于第28-33天用OVA經(jīng)鼻刺激，建立小鼠過敏性哮喘模型。于最后一次激發(fā)24 h后，取血測(cè)定外周血白細(xì)胞(WBC)分型;取血清及肺泡灌洗液(BALF)，測(cè)定血清中OVA特異性IgE及BALF中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ的水平;流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)BALF中不同免疫細(xì)胞亞型比例的改變;HE及PAS染色檢測(cè)小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤及支氣管周杯狀細(xì)胞增生情況;實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織中細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平;Weste

7、rn blot方法檢測(cè)小鼠肺組織炎癥相關(guān)蛋白MCP-1、VCAM-1和COX-2的表達(dá)水平，并檢測(cè)炎癥相關(guān)信號(hào)通路蛋白絲裂原激活蛋白激酶MAPKs及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活情況。同時(shí)采用豚鼠氣管環(huán)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TIPP對(duì)組胺、乙酰甲膽堿刺激的氣管平滑肌收縮的影響。
　　3.TIPP體外抗過敏活性及機(jī)制研究
　　采用抗原DNP-HSA對(duì)anti-DNP-IgE致敏的RBL-2H3細(xì)胞進(jìn)行刺激，檢測(cè)TIPP對(duì)IgE-抗原復(fù)合物刺激的

8、RBL-2H3細(xì)胞激活的影響。主要包括:檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中β-氨基己糖苷酶活性及組胺含量，分析TIPP對(duì)脫顆粒的影響;用Ca2+熒光探針Fluo3-AM檢測(cè)TIPP對(duì)激活的RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TIPP對(duì)IgE介導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞激活時(shí)相關(guān)炎癥因子mRNA水平的影響;用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記細(xì)胞骨架蛋白F-actin，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)TIPP對(duì)IgE-抗原復(fù)合物刺激RBL-2H3細(xì)胞激

9、活時(shí)膜波動(dòng)的影響;Western blot方法檢測(cè)TIPP對(duì)IgE-抗原復(fù)合物刺激RBL-2H3細(xì)胞激活時(shí)COX-2的表達(dá)水平、信號(hào)通路相關(guān)蛋白及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活的影響。
　　4.尋找TIPP靶點(diǎn)
　　采用激光共聚焦顯微鏡觀察TIPP與RBL-2H3細(xì)胞的結(jié)合情況，并用流式細(xì)胞技術(shù)分析TIPP濃度、作用時(shí)間、孵育溫度對(duì)TIPP與RBL-2H3細(xì)胞的結(jié)合的影響。用生物素標(biāo)記TIPP，采用HuProtTM人類蛋白質(zhì)組芯片

10、檢測(cè)與TIPP有相互作用的蛋白質(zhì)，結(jié)合之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)TIPP可能作用靶點(diǎn)。并檢測(cè)TIPP對(duì)K562細(xì)胞（Bcr-Abl陽性表達(dá)）和HL60細(xì)胞（Bcr-Abl陰性表達(dá)）增殖的抑制作用。
　　結(jié)果：
　　1.TIPP具有免疫抑制活性且活性與結(jié)構(gòu)相關(guān)
　　TIPP對(duì)Con A及LPS刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖均有抑制作用，但對(duì)ConA刺激的小鼠脾淋巴T細(xì)胞增殖的抑制作用更為顯著，并能抑制因LPS刺激引起的小鼠RAW26

11、4.7細(xì)胞的吞噬能力的增強(qiáng)。TIPP對(duì)未加絲裂原刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞及RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞生存率沒有影響，即TIPP沒有細(xì)胞毒性，其對(duì)Con A/LPS刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖及LPS刺激引起的小鼠RAW264.7細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)的抑制作用并不是因其毒性作用產(chǎn)生的。TIPP免疫抑制活性的發(fā)揮與其自身的結(jié)構(gòu)相關(guān)，但其Cys4的-SH基團(tuán)對(duì)TIPP抑制活性的發(fā)揮起一定的增強(qiáng)作用。當(dāng)TIPP的-SH變?yōu)?OH時(shí)，其活性降低顯著。

12、>　　2.TIPP能顯著抑制哮喘小鼠肺部炎癥的發(fā)生
　　TIPP可以顯著抑制哮喘小鼠肺部炎癥的發(fā)生，體內(nèi)給藥毒副作用小。TIPP顯著降低哮喘小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)并能有效抑制BALF中不同亞型細(xì)胞比例的改變;組織切片分析表明TIPP對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤及支氣管周杯狀細(xì)胞增生有抑制作用;TIPP可有效抑制哮喘小鼠血清中OVA特異性IgE的水平和BALF中IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ的水平，并能顯著抑制肺組織中炎癥

13、因子IL-4、TNF-α及eotaxin-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平;Western blot結(jié)果顯示TIPP可有效地抑制哮喘小鼠肺組織炎癥相關(guān)蛋白MCP-1、VCAM-1和COX-2的表達(dá)水平，并能有效抑制炎癥相關(guān)信號(hào)通路蛋白MAPKs及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活。豚鼠氣管環(huán)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TIPP對(duì)乙酰甲膽堿及組胺引起的氣管平滑肌的收縮并沒有直接的抑制作用，即TIPP抗哮喘作用的發(fā)揮并不是直接的支氣管舒張作用，而是依賴于其抗炎活性。

14、　　3.TIPP抑制Raf/MEK/ERK信號(hào)通路及NF-κB的核移位
　　TIPP主要作用于抗原刺激階段，可顯著抑制因抗原DNP-HSA刺激的致敏RBL-2H3細(xì)胞激活引起的脫顆粒，抑制因抗原刺激導(dǎo)致的RBL-2H3細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的增高和膜波動(dòng)的發(fā)生，對(duì)抗原刺激引起的細(xì)胞內(nèi)相關(guān)炎癥因子IL-3、IL-4、IL-6、IL-13、TNF-α及MCP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄有抑制作用，并能抑制COX-2蛋白的表達(dá)。Western blo

15、t分析TIPP的作用機(jī)制，結(jié)果表明TIPP可顯著抑制Raf/MEK/ERK信號(hào)通路及NF-κB的核移位，而對(duì)JNK、p38、AKT的激活沒有影響。
　　4.生長因子受體結(jié)合蛋白Grb2是TIPP的可能作用靶點(diǎn)
　　激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TIPP可以與RBL-2H3細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合，并能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TIPP與RBL-2H3細(xì)胞的結(jié)合具有濃度、時(shí)間、溫度依賴性;HuProtTM人類蛋白質(zhì)組芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TIP

16、P與生長因子受體結(jié)合蛋白Grb2有特異性相互作用，其熒光信號(hào)值（扣除背景值后）達(dá)1187.500±27.577，信噪比SNR為26.159±0.998。Raf/MEK/ERK是Ras下游信號(hào)通路，而Grb2又是Ras激活所需的重要銜接蛋白，因此我們推測(cè)TIPP可能是Ras信號(hào)通路上游重要銜接蛋白Grb2的阻斷劑，TIPP通過與Grb2蛋白的SH2或SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻斷其與上游酪氨酸激酶LAT酪氨酸磷酸化位點(diǎn)或與下游SOS蛋白的結(jié)合，阻

17、斷了Ras信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮其抗炎抗過敏作用的。此外，與HL60細(xì)胞（Bcr-Abl陰性表達(dá)）相比，TIPP對(duì)Bcr-Abl陽性表達(dá)細(xì)胞K562增殖的抑制作用更為顯著，能將其阻滯在G2期。TIPP對(duì)K562細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出更明顯的抑制活性，這與TIPP是Grb2阻斷劑這一假設(shè)符合。
　　結(jié)論：
　　(1)首次對(duì)胸腺免疫抑制五肽TIPP的免疫抑制活性進(jìn)行了研究。TIPP對(duì)Con A/LPS刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖及LP

18、S刺激的小鼠RAW264.7吞噬能力的增強(qiáng)均有抑制作用，且無細(xì)胞毒性。
　　(2)對(duì)TIPP活性與結(jié)構(gòu)關(guān)系進(jìn)行了初探。TIPP活性的發(fā)揮與其自身的結(jié)構(gòu)相關(guān)，但其Cys4的-SH基團(tuán)對(duì)TIPP抑制活性的發(fā)揮起一定的增強(qiáng)作用。
　　(3)首次對(duì)TIPP體內(nèi)抗哮喘氣道炎癥作用進(jìn)行了研究。TIPP可有效的抑制哮喘小鼠肺部炎癥的發(fā)生，且體內(nèi)給藥毒副作用小。
　　(4)首次對(duì)TIPP體外抗過敏活性進(jìn)行了研究。TIPP可以有效地抑制

19、IgE-抗原復(fù)合物刺激的RBL-2H3細(xì)胞的激活。
　　(5)首次對(duì)TIPP作用機(jī)制進(jìn)行了研究。TIPP可以抑制Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的激活及NF-κB的核移位，抑制IgE-抗原復(fù)合物刺激的RBL-2H3細(xì)胞的激活。TIPP可能是Grb2的阻斷劑，通過與Grb2蛋白結(jié)合，阻斷了Ras信號(hào)通路的激活，從而發(fā)揮其抗炎抗過敏作用的。
　　(6)對(duì)TIPP是Grb2阻斷劑這一機(jī)制進(jìn)行初步驗(yàn)證。與Bcr-Abl陰性表達(dá)細(xì)胞HL