短鏈胸腺基質(zhì)淋巴生成素對(duì)甲苯二異氰酸酯誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　二異氰酸酯類是一類重要的致敏原，被廣泛應(yīng)用于剛性或軟質(zhì)聚氨酯泡沫工業(yè)生產(chǎn)中，作為一種良好的硬化劑也被應(yīng)用于聚氨酯噴涂涂料和粘合劑生產(chǎn)中，是許多工業(yè)化國家中導(dǎo)致職業(yè)性哮喘最常見的原因。甲苯二異氰酸酯(TDI)是其主要類型之一，TDI所導(dǎo)致的職業(yè)性哮喘可產(chǎn)生典型的哮喘病理特征，主要包括:氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥，氣道炎癥主要與淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤相關(guān)。然而針對(duì)其所導(dǎo)致的哮喘炎癥機(jī)制研究仍然十分匱乏。

2、　　胸腺基質(zhì)淋巴生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一種類白介素(IL-7)細(xì)胞因子。TSLP主要表達(dá)于上皮細(xì)胞和皮膚角質(zhì)細(xì)胞。近來研究表明，其他細(xì)胞類型如肥大細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞以及腫瘤或腫瘤相關(guān)細(xì)胞均可以表達(dá)TSLP。在受到各種內(nèi)源性或外源性物質(zhì)刺激時(shí)，TSLP表達(dá)增多，并與機(jī)體紊亂或維持穩(wěn)態(tài)相關(guān)。如氣道受到外界過敏原如屋塵螨或病原體刺激時(shí)會(huì)分泌大量的TSLP

3、，進(jìn)而作用于樹突狀細(xì)胞，上調(diào)OX40配體，促進(jìn)炎癥因子IL-4，IL-5，IL-13和TNF-γ表達(dá)及釋放，而反過來，高水平IgE和Th2相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-4，IL-13，IL-25和IL-33)又可以促進(jìn)TSLP的表達(dá)，從而形成正反饋，不斷放大氣道Th2炎癥，促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明在卵清蛋白(OVA)哮喘小鼠模型中敲除TSLP受體后，氣道炎癥明顯改善。而予以肺部過表達(dá)TSLP后，再予過敏原刺激，小鼠可出現(xiàn)明顯的氣道嗜酸性粒細(xì)

4、胞炎癥、粘液高分泌及氣道重塑。在臨床哮喘患者中，TSLP表達(dá)明顯升高，并與氣道炎癥及氣道阻塞呈正相關(guān)，而予以TSLP單克隆抗體治療后可明顯改善哮喘患者臨床癥狀。因此，TSLP與哮喘的發(fā)病更是息息相關(guān)。
　　然而，最新研究表明，人TSLP具有兩種亞型，即長(zhǎng)鏈TSLP(long TSLP,lTSLP)和短鏈TSLP(short TSLP，shTSLP)，他們結(jié)構(gòu)相似，作用卻完全不同。Long TSLP即全長(zhǎng)TSLP(full-leng

5、th TSLP)，其分子量大小為25KDa，既往絕大多數(shù)關(guān)TSLP的研究主要指long TSLP，最早發(fā)現(xiàn)TSLP亞型區(qū)別的是日本的一位學(xué)者Harada M，他首次報(bào)道了當(dāng)人氣道上皮細(xì)胞系受到poly(I∶C)刺激時(shí)會(huì)促進(jìn)long TSLP表達(dá)，而不是shortTSLP，因此提示了long TSLP才是導(dǎo)致Th2炎癥的關(guān)鍵因子，與shortTSLP的作用可能具有差異性。而最近有關(guān)TSLP亞型的研究進(jìn)一步明確了他們的差異性，在小鼠腸炎模型

6、中，shortTSLP治療后可明顯改善小鼠體重減輕并更快恢復(fù)，表明short TSLP可以保護(hù)腸炎。而且，short TSLP在體外亦可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，發(fā)揮抗菌活性。而本課題組最新研究亦表明在屋塵螨哮喘動(dòng)物模型中short TSLP亦發(fā)揮了一定的抗炎及氣道屏障保護(hù)作用。那么，基于TSLP亞型的作用差異性，尤其是short TSLP的抗炎作用，大大提高了我們對(duì)TSLP的認(rèn)識(shí)，目前有關(guān)short TSLP在哮喘中的作用仍少見報(bào)道，我們有必

7、要進(jìn)一步探討short TSLP對(duì)哮喘氣道炎癥的影響及其可能的作用機(jī)制。本研究第一個(gè)目的，應(yīng)用TDI哮喘小鼠模型，予以short TSLP多肽處理后，觀察其對(duì)氣道炎癥的影響。
　　氣道上皮細(xì)胞作為氣道與外界環(huán)境的第一道防線，不僅發(fā)揮著物理屏障的作用，更是一道免疫屏障，當(dāng)氣道上皮受到外界各種過敏原和病原體刺激時(shí)，會(huì)分泌大量的炎癥介質(zhì)，如IL-25、IL-33、TSLP、HMGB1等，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及啟動(dòng)哮喘氣道炎癥的作用。本課題組

8、前期研究中已經(jīng)證明，高遷移率族蛋白1(HMGB1)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)軸在TDI哮喘氣道炎癥中發(fā)揮了重要作用，并可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路，因此本研究的第二個(gè)目的，在體外合成TDI-HSA復(fù)合物并刺激人氣道上皮細(xì)胞系16HBE細(xì)胞，觀察其對(duì)HMGB1-RAGE軸信號(hào)及TSLP亞型表達(dá)的影響，以及short TSLP在其中的作用。
　　方法:
　　1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　1.1 建立TDI哮喘小鼠模型，

9、分別通過氣管內(nèi)給藥和腹腔注射給藥方式在每次激發(fā)前30min予以short TSLP處理小鼠
　　1.2 檢測(cè)小鼠氣道高反應(yīng)性
　　1.3 動(dòng)物標(biāo)本檢測(cè):取血并檢測(cè)血清總IgE水平，小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)并檢測(cè)淋巴上清中Th1相關(guān)炎癥介質(zhì)IFN-γ及Th2相關(guān)炎癥介質(zhì)IL-4，IL-5，IL-13分泌水平，支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，小鼠肺組織病理染色，肺組織HMGB1，RAGE，TSLP及信號(hào)分子p-STAT3、p-

10、STAT5的免疫組化及蛋白免疫印記。
　　2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　2.1 體外培養(yǎng)正常人氣道上皮細(xì)胞系16HBE細(xì)胞，分別用TDI-HSA和rhHMGB1處理細(xì)胞，并予以shortTSLP進(jìn)行預(yù)處理。
　　2.2 蛋白印記及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)16HBE細(xì)胞HMGB1，RAGE，lTSLP及多種信號(hào)通路蛋白及l(fā)TSLP和shTSLP mRNA的表達(dá)
　　2.3 細(xì)胞免疫熒光雙染技術(shù)檢測(cè)HMGB1-RAGE在細(xì)胞中的表達(dá)

11、分布情況
　　3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間總體均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用Bonferonni方法，方差不齊時(shí)用Dunnett's T3方法，以p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　1.1 TDI組小鼠氣道反應(yīng)性明顯增高，而short TSLP治療后明顯改善氣道高反應(yīng)性，并且抑制TDI小鼠血清總IgE水平，

12、減少TDI哮喘小鼠淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1相關(guān)炎癥介質(zhì)IFN-γ及Th2相關(guān)炎癥介質(zhì)IL-4，IL-5，IL-13釋放，BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果示:TDI組嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯增多，而予short TSLP治療后明顯減少。肺組織病理結(jié)果示:TDI組小鼠氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤明顯，氣道上皮增厚，呈增生改變，而short TSLP治療組其炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，氣道增生不明顯。
　　1.2 TDI小鼠肺組織HMGB1、RAGE、T

13、SLP及p-STAT5表達(dá)明顯增多，而予以shortTSLP治療后明顯減少。
　　2. 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　2.1 TDI-HSA和rhHMGB1均可促進(jìn)RAGE和long TSLP表達(dá)及信號(hào)分子STAT5(Y694)、Akt(S473)和p38MAPK(T180/Y182)的磷酸化。
　　2.2 short TSLP可抑制RAGE和long TSLP蛋白表達(dá)及Akt(S473)、p38MAPK(T180/Y182)和STA