牙本質(zhì)源性蛋白誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞分化及促進(jìn)牙周再生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙根發(fā)育早期，牙囊細(xì)胞、上皮根鞘和牙乳頭細(xì)胞相互作用，形成了牙根牙周組織。經(jīng)典理論認(rèn)為，牙周前體細(xì)胞—牙囊細(xì)胞穿透斷裂的上皮根鞘與牙根接觸并相互作用，分化成為成牙骨質(zhì)細(xì)胞并形成牙骨質(zhì)。我們最近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：牙本質(zhì)非膠原蛋白能夠誘導(dǎo)大鼠牙囊細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2007年底，Sonoyama等人利用組織工程方法，將發(fā)育期根尖牙乳頭細(xì)胞與牙周膜干細(xì)胞順序復(fù)合多孔HA/TCP材料，在小型豬頜骨內(nèi)自體移植，利用兩種細(xì)胞的相互作用，成功構(gòu)建出

2、具有生物活性的牙根牙周結(jié)構(gòu)，并在人工牙根上成功制作義齒修復(fù)。在臨床實(shí)際操作中，牙周炎患牙的牙周潔治與根面平整，以及局部的抗炎處理是促進(jìn)牙周再生的前提。通過(guò)物理或化學(xué)的方法進(jìn)行牙根表面處理，其目的是為了去除牙根表層的玷污層，改善根面周圍的局部微環(huán)境，暴露新鮮的牙本質(zhì)或牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白，增加局部的趨化刺激因子，以此來(lái)誘導(dǎo)牙周細(xì)胞的牙根表面貼附性，促進(jìn)牙周再生9,10。因此可以推斷這些暴露的牙本質(zhì)相關(guān)蛋白有可能作為細(xì)胞趨化因子誘導(dǎo)牙周細(xì)胞牙根表

3、面的貼附、增殖及分化。
　　牙本質(zhì)膠原與非膠原蛋白（DNCPs）是一組細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的總稱，包括牙本質(zhì)涎蛋白，磷蛋白和各種多肽生長(zhǎng)因子，部分蛋白已被證實(shí)可作為細(xì)胞因子誘導(dǎo)牙本質(zhì)周圍的多種胚胎或成體干細(xì)胞細(xì)胞分化。基于牙周發(fā)育學(xué)的生理基礎(chǔ)與牙周治療的臨床操作實(shí)際角度，合并我實(shí)驗(yàn)室以前的研究結(jié)果，我們認(rèn)為牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白可能在牙周再生修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。牙周膜干細(xì)胞是近兩年發(fā)現(xiàn)的牙周膜內(nèi)的多潛能前體細(xì)胞，在維持牙周自身內(nèi)環(huán)境

4、穩(wěn)定，保持牙周膜新陳代謝平衡及牙周損傷修復(fù)發(fā)揮著重要作用。牙周膜干細(xì)胞具有自我更新與多向分化能力，可作為牙周關(guān)系中各種不同類型細(xì)胞的能源儲(chǔ)備細(xì)胞，因此現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為牙周膜干細(xì)胞在促進(jìn)牙周再生方面具有重要的研究與實(shí)際意義。發(fā)育期根尖牙乳頭細(xì)胞是成牙本質(zhì)及牙髓細(xì)胞的前體細(xì)胞，在細(xì)胞增殖、分化并合成基質(zhì)形成了牙根的牙本質(zhì)和牙髓組織，因此認(rèn)為牙根的牙乳頭細(xì)胞在牙根發(fā)育，牙周形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)擬探討牙本質(zhì)非膠原蛋白（DNCPs）對(duì)牙

5、周膜干細(xì)胞（HPDLSCs）是否具有定向誘導(dǎo)作用。研究體外DNCPs對(duì)HPDLSCs的生物學(xué)效應(yīng)，體內(nèi)在生物支架材料表面促進(jìn)再生牙周樣結(jié)構(gòu)的能力。本研究是第一次引入牙本質(zhì)來(lái)源的基質(zhì)蛋白誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞在牙本質(zhì)表面構(gòu)建牙周組織結(jié)構(gòu)，此研究策略一旦成功，必將對(duì)牙周組織再生拓展新的研究思路，為牙周炎的臨床治療提供新的方法。
　　課題研究目的：
　　探討以人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）作為牙周組織工程種子細(xì)胞的可行性；分析牙本質(zhì)相

6、關(guān)蛋白（DNCPs）或根尖牙乳頭干細(xì)胞基質(zhì)蛋白對(duì)hPDLSCs細(xì)胞行為的影響。探討經(jīng)DNCPs誘導(dǎo)的hPDLSCs復(fù)合脫礦、脫蛋白牙本質(zhì)的方式或根尖牙乳頭干細(xì)胞與牙周膜干細(xì)胞順序接種生物支架的方式構(gòu)建組織工程化的牙根牙周組織的可行性。
　　課題研究?jī)?nèi)容
　?、俜蛛x培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）作為牙周再生組織工程的種子細(xì)胞，鑒定其干細(xì)胞特性及多向分化潛能（成脂、成骨分化）。
　?、诜蛛x培養(yǎng)人發(fā)育期根尖牙乳頭干細(xì)胞

7、，鑒定其干細(xì)胞特性，觀察種子細(xì)胞與生物支架材料復(fù)合后的生長(zhǎng)特點(diǎn)，生成基質(zhì)的特性；
　　②體外觀察DNCPs對(duì)牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）增殖與分化能力的影響；
　?、垠w外觀察DNCPs對(duì)牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）細(xì)胞大體形態(tài)的影響，細(xì)胞牙本質(zhì)表面黏附能力的影響；
　　④體內(nèi)觀察DNCPs能否誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）在牙本質(zhì)表面形成牙周樣結(jié)構(gòu)；
　　⑤hPDLSCs與hRAPSCs順序接種生物支架材

8、料，異位移植觀察根尖牙乳頭細(xì)胞生成的基質(zhì)對(duì)hPDLSCs牙周再生能力的影響；
　　⑥利用明膠微球緩釋特性，合成適合hPDLSCs生長(zhǎng)分化及組織再生的膠原-羥基磷灰石-明膠微球/緩釋TGF-β1的多孔支架材料。
　　主要研究方法
　　1利用酶消化結(jié)合組織塊法在成人健康牙周膜中培育人牙周膜細(xì)胞；通過(guò)收集多個(gè)克隆化生長(zhǎng)的細(xì)胞，并將其培育在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，獲得牙周膜干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物STRO-1檢測(cè)細(xì)胞；干細(xì)胞成

9、骨誘導(dǎo)與成脂誘導(dǎo)，觀察多向分化能力。
　　2分離年輕智齒的根尖部分組織，利用酶消化法培養(yǎng)了根尖牙乳頭細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了干細(xì)胞鑒定與多向誘導(dǎo)分化。細(xì)胞接種珊瑚羥基磷灰石支架，觀察牙本質(zhì)基質(zhì)生成情況，免疫組化染色觀察基質(zhì)特性。
　　3DNCPs溶解于DMEM培養(yǎng)基，精調(diào)pH值制成1ug/ml溶液。以DNCPs溶解的DMEM培養(yǎng)基（2％胎牛血清，50ug/ml維生素C,2mmol/L谷胺酰胺,100U/ml青霉素,100μg/ml

10、鏈霉素）為A液；不添加DNCPs的DMEM培養(yǎng)基為B液。以MTT法，BrdU吸收率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)A液與B液孵育的牙周膜干細(xì)胞增殖活性。
　　4以倒置顯微鏡，掃描顯微鏡觀察經(jīng)A液與B液孵育的牙周膜細(xì)胞大體形態(tài)變化；以RT-PCR為手段檢測(cè)成骨標(biāo)志物COL,OCN,ALP的PCR水平變化；檢測(cè)誘導(dǎo)前后堿磷酶變化；檢測(cè)誘導(dǎo)前后對(duì)對(duì)牙周膜干細(xì)胞礦化形成能力的影響。
　　5改良方法制作部分脫礦、脫蛋白牙本質(zhì)支架材料，干細(xì)胞體外支架接

11、種，觀察細(xì)胞貼附與伸展效果；觀察DNCPs誘導(dǎo)下對(duì)牙周膜干細(xì)胞平皿貼壁速度與能力的影響。
　　6DNCPs孵育的HPDLSCs接種CCRD支架，裸鼠體內(nèi)移植，四周后觀察牙周組織在牙本質(zhì)表面再生的情況。
　　7制作Collagen/HA/GM具有緩釋支架材料，觀察生長(zhǎng)因子緩釋效果。支架接種牙周膜干細(xì)胞，裸鼠體內(nèi)移植，觀察組織再生及因子緩釋效果。
　　課題主要研究結(jié)果
　　①利用酶消化結(jié)合組織塊法在成人健康牙周膜和培

12、育了人牙周膜細(xì)胞（hPDLSCs）；對(duì)干細(xì)胞特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究：包括主要干細(xì)胞標(biāo)志物檢測(cè)；克隆形成能力分析；多向分化能力檢測(cè)。牙周膜細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物STRO-1檢出細(xì)胞群29.01％為陽(yáng)性；干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)3周，茜素紅染色，細(xì)胞周圍出現(xiàn)大量、片狀礦化基質(zhì)；成脂誘導(dǎo)液干細(xì)胞孵育3周，油紅O染色，大量細(xì)胞出現(xiàn)脂滴陽(yáng)性染色。
　　②利用酶消化法在根尖組織中分離、培養(yǎng)了人根尖牙乳頭干細(xì)胞(hRAPSCs)。
　?、劢?jīng)MTT法檢

13、測(cè)DNCPs可以促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）增殖，DNCPs孵育的hPDLSCs的BrdU吸收率有統(tǒng)計(jì)意義的提高；DNCPs處理的hPDLSCs細(xì)胞分裂相增加。DNCPs孵育的hPDLSCs細(xì)胞貼壁能力明顯增強(qiáng)。
　?、芙?jīng)DNCPs誘導(dǎo)的牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）可以增加COL,OCN,ALP的PCR水平，礦化基質(zhì)形成能力明顯增強(qiáng)。形態(tài)學(xué)檢測(cè)牙周膜干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化。
　?、軩NCPs誘導(dǎo)的牙周膜干細(xì)胞（hP

14、DLSCs）可以促進(jìn)其在牙本質(zhì)表面牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)與牙周纖維樣結(jié)構(gòu)再生。
　　⑥根尖牙乳頭干細(xì)胞(hRAPSCs)在生物支架表面形成了礦化的牙本質(zhì)基質(zhì)，這種牙本質(zhì)基質(zhì)可誘導(dǎo)牙周膜干細(xì)胞在其表面的牙周再生。
　?、邩?gòu)建出適合hPDLSCs生長(zhǎng)分化的Collagen/HA/GM具有緩釋TGF-β1功能的支架材料。
　　結(jié)論
　　我們的研究證實(shí)，DNCPs是有效的刺激因子可促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞增殖及成牙骨質(zhì)向分化，促使HPDL