Leptin和GDNF對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟的旁分泌調(diào)節(jié)機(jī)制.pdf

1、目的： 探討瘦素和膠質(zhì)細(xì)胞來源的神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)是否有通過旁分泌機(jī)制調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟的可能。 材料和方法： 1.DNA基因芯片分析鼠齡為21天的雌性B6D2F1小鼠，每只注射7.5單位Humegon促卵泡發(fā)育。48小時(shí)后，部分小鼠每只注射5單位Pregny1誘發(fā)排卵。取卵巢提取RNA，然后與Affymetrix的小鼠M

2、GU74v2芯片A，B，C雜交。 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測瘦素和GDNF以及受體在hCG作用后變化情況。 3.免疫組織化學(xué)研究生長因子(瘦素和GDNF)在卵巢各細(xì)胞中的表達(dá)。 4.采用卵泡培養(yǎng)研究瘦素和GDNF對(duì)小鼠卵母細(xì)胞生殖泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)的作用。 5.對(duì)卵-卵丘復(fù)合物(COCs)和裸卵進(jìn)行培養(yǎng)，研究瘦素和GDNF對(duì)小鼠卵母細(xì)胞第一極體釋放的作

3、用。 6.采用體外成熟-采用體外受精-胚胎培養(yǎng)研究瘦素和GDNF對(duì)小鼠卵母細(xì)胞胞漿成熟的作用。 結(jié)果： 1.基因芯片結(jié)果顯示：hCG刺激后，小鼠卵巢瘦素的mRNA表達(dá)量變化不明顯，但受體表達(dá)量顯著上升。與瘦素結(jié)果不同，hCG刺激后，GDNF及其受體的表達(dá)量均明顯上升。 2.與基因芯片的結(jié)果基本一致，注射hCG后，瘦素的表達(dá)量改變不明顯；Ob-Ra的表達(dá)量顯著上升，Ob-Rb的表達(dá)量也有所上升，但不如Ob-

4、Ra顯著。GDNF及其受體Gfra1的mRNA表達(dá)量均顯著上升。在卵巢各細(xì)胞組分中，小鼠卵母細(xì)胞Ob-Ra的mRNA水平在注射hCG后顯著上升，而Ob-Rb的mRNA水平無明顯變化。小鼠卵母細(xì)胞的GDNF mRNA水平幾乎檢測不到。hCG作用后，卵丘細(xì)胞和壁層顆粒細(xì)胞的GDNF，Gfra1和Ret mRNA水平顯著上升，而卵母細(xì)胞的Gfra1和Ret mRNA水平無明顯變化。 3.免疫組化結(jié)果：瘦素在卵細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞

5、中呈強(qiáng)陽性表達(dá)；在排卵前卵泡的顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中也呈陽性，竇前卵泡和小卵泡的顆粒細(xì)胞瘦素蛋白表達(dá)呈陰性。GDNF蛋白在排卵前卵泡的卵丘細(xì)胞、靠近卵泡腔的壁層顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞中表達(dá)呈陽性，小卵泡的GDNF蛋白表達(dá)呈陰性。 4.體外培養(yǎng)條件下添加瘦素能促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞GVBD的發(fā)生和第一極體釋放，而MEK 1/2抑制劑能阻斷這種促進(jìn)作用。體外培養(yǎng)中添加GDNF能促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞第一極體釋放，但對(duì)GVBD無明顯影響。 5

6、.在體外成熟培養(yǎng)階段添加瘦素能促使MⅡ期卵母細(xì)胞的受精率和囊胚形成率增加。在IVM階段添加GDNF對(duì)MⅡ期卵母細(xì)胞的受精率和囊胚形成率無明顯影響。 結(jié)論： 1)LH/hCG能使小鼠卵母細(xì)胞的Ob-Ra表達(dá)量增加。小鼠卵巢的卵丘細(xì)胞、壁層顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生瘦素。 2)體外培養(yǎng)條件下，瘦素能促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞GVBD的發(fā)生和第一極體的釋放，而且，Ob-Ra/MEK 1/2信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)參與介導(dǎo)了瘦素對(duì)小鼠卵母細(xì)胞核