三種化學(xué)方法制備脫細(xì)胞神經(jīng)的比較及新型神經(jīng)支架材料的制備.pdf

1、周?chē)窠?jīng)(peripheral nerve,PN)損傷后的再生，特別是缺損的修復(fù)一直是臨床上一大難題。對(duì)于短的周?chē)窠?jīng)缺損可以直接縫合，而長(zhǎng)段的神經(jīng)缺損常用的治療方法是自體神經(jīng)移植。但供移植的神經(jīng)為皮神經(jīng)，其直徑小，膜管小，直徑粗的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)軸索難以長(zhǎng)入，神經(jīng)功能恢復(fù)不全，不能滿足臨床神經(jīng)移植的需要，自體神經(jīng)移植會(huì)給供區(qū)帶來(lái)永久性神經(jīng)功能障礙。因此，研發(fā)能夠有效代替自體神經(jīng)的移植的替代物是目前亟待解決的難題。近年來(lái)，隨著組織工程的興起，組

2、織工程化神經(jīng)已成為目前研究的焦點(diǎn)。應(yīng)用組織工程學(xué)方法制備組織工程支架材料接長(zhǎng)節(jié)段神經(jīng)缺損收到較好療效，受到了越來(lái)越多的關(guān)注。支架材料的組成及內(nèi)部微結(jié)構(gòu)是影響組織工程移植物修復(fù)長(zhǎng)節(jié)段神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素。鑒于正常神經(jīng)基底膜微管結(jié)構(gòu)引導(dǎo)再生神經(jīng)軸突定向生長(zhǎng)的關(guān)鍵作用，如果支架材料具備正常神經(jīng)組織的特性，將會(huì)成為最理想的移植替代修復(fù)材料。
　　本實(shí)驗(yàn)分兩部分。
　　第一部分、三種化學(xué)方法制備脫細(xì)胞神經(jīng)的比較
　　目的：通過(guò)對(duì)三

3、種化學(xué)脫細(xì)胞法制備脫細(xì)胞神經(jīng)的比較，選擇一種最合適的脫細(xì)胞神經(jīng)制備方法。
　　方法：
　　1、分別用溶血軟卵磷脂法、用三硝基甲苯和脫氧膽酸鈉溶液在室溫下交替處理法以及用疊氮鈉、三硝基甲苯、脫氧膽酸鈉溶液順序處理法處理SD大鼠坐骨神經(jīng)，制備脫細(xì)胞神經(jīng)；
　　2、通過(guò)石蠟切片對(duì)這三種脫細(xì)胞材料進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)；
　　3、對(duì)這三種材料進(jìn)行生物相容性評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：
　　1.三種脫細(xì)胞神經(jīng)支架直徑和長(zhǎng)度無(wú)明顯

4、變化,質(zhì)軟而有韌性、乳白色、半透明，彈性較新鮮神經(jīng)組織略差，韌性比新鮮神經(jīng)略強(qiáng)，延展性較萃取前略增加，可在無(wú)張力條件下行常規(guī)的神經(jīng)吻合。
　　2.HE Dumont萃取法橫切片上可見(jiàn)到軸突細(xì)胞溶解碎片，細(xì)胞萃取不徹底，紅染的雪（schwann cell basilar membrane SCBM）形成的不規(guī)則圓形空腔。縱切片上，紅染的SCBM呈波浪狀縱形排列，軸突、髓鞘結(jié)構(gòu)消失而形成管柱狀空隙；Sondell法在橫切片中紅染的SC

5、BM圓形空腔間出現(xiàn)了大的空隙，縱切片中紅染的SCBM管形間出現(xiàn)了大的空隙；而Haase法在縱、橫切片上,SCBM的排列均勻一致，均未出現(xiàn)大空隙。
　　3.層粘蛋白免疫組化染色：Dumont法橫切片上黃染的SCBM被保留，圍繞著空的神經(jīng)內(nèi)膜管。在縱切片上可見(jiàn)正常神經(jīng)結(jié)構(gòu)消失，而黃染的SCBM則被保留，呈波浪狀縱形排列。Sondell法在橫切片上可見(jiàn)神經(jīng)組織髓鞘結(jié)構(gòu)消失，黃染的SCBM形成不規(guī)則的圓形空腔。大的空隙Haase法,,SC

6、BM MTT比色方法顯示三組萃取的神經(jīng)支架材料細(xì)胞毒性均為0級(jí)。直接接觸法顯示細(xì)胞毒性：Haase法優(yōu)于Sondell法，而Sondell法優(yōu)于Dumont法。
　　4.體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：MTT比色方法顯示三組萃取的神經(jīng)支架材料細(xì)胞毒性均為0級(jí)。直接接觸法顯示細(xì)胞毒性：Haase法優(yōu)于Sondell法，而Sondell法優(yōu)于Dumont法。
　　5植入后局部反應(yīng)實(shí)驗(yàn)：炎癥細(xì)胞反應(yīng)程度指標(biāo)顯示1、2、4周，Haase法炎癥反應(yīng)

7、程度明顯低于Dumont及Sondell法：而Sondell法則優(yōu)于Dumont法。纖維囊腔形成程度指標(biāo)顯示Haase法稍優(yōu)于Sondell法；而Sondell法則明顯優(yōu)于Dumont法。
　　結(jié)論：通過(guò)對(duì)這三種脫細(xì)胞材料形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)、體外細(xì)胞毒性和植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)，證實(shí)了Haase法優(yōu)于Dumont法及Sondell法。
　　第二部分、新型神經(jīng)支架材料的制備
　　方法：
　　1、選擇Haase萃取法對(duì)槍烏賊神經(jīng)