小鼠心臟脫細胞支架的制備及初步評價.pdf

1、目的：在改良已有方法基礎上，制備小鼠脫細胞心臟支架，探究其組成、成分及結構，建立“骨髓間充質干細胞(BMSCs)-脫細胞心臟支架”共培養(yǎng)體系，評價脫細胞心臟支架在細胞生長、分化等方面的細胞生物學特性;探究脫細胞心臟支架及BMSCs在心臟組織工程研究中潛在應用價值，為進一步開展相關的組織工程研究及應用，建立實驗基礎。
　　方法：本實驗聯(lián)合應用胰蛋白酶、十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonⅩ-100)對修剪后的大

2、鼠心臟浸泡震蕩，以快速脫除細胞。以HE染色觀察支架內細胞殘留;超微分光光度計檢測脫細胞支架的DNA殘留;掃描電鏡觀察支架的形態(tài)和纖維排列規(guī)律;Masson染色分析支架的成分;免疫組織化學染色檢測脫細胞支架Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、肌紅蛋白、肌動蛋白。選用BMSCs與脫細胞心臟支架體外構建“細胞-支架復合物”共培養(yǎng)體系，選擇共培養(yǎng)7d、14d的“細胞-支架復合物”，HE染色觀察細胞在支架中的分布情況;掃描電鏡觀察“細胞-復合物”中細胞的

3、粘附情況。以心肌組織裂解液進行定向誘導培養(yǎng)，實時熒光定量PCR檢測誘導后“細胞-支架復合物”中GATA-4和α-MHC的表達。
　　結果：
　　1、脫細胞處理后的心臟支架呈半透明囊狀，HE染色觀察未見細胞核殘留，SEM可見脫細胞支架由大量纖維構成，呈多孔網(wǎng)狀結構。
　　2、脫細胞心臟支架成分的檢測，總DNA含量為43.75±0.03ng/μL;Masson染色可見脫細胞支架主要由網(wǎng)狀膠原纖維構成;免疫組織化學染色可見，

4、脫細胞心臟支架主要由Ⅰ型膠原蛋白及少量Ⅲ型膠原蛋白組成，未見細胞核與肌紅蛋白、肌動蛋白表達。
　　3、“細胞-支架復合物”HE染色可見，細胞分布在脫細胞支架內部，比較共培養(yǎng)7d、14d的“細胞-支架復合物”，支架內的細胞數(shù)量明顯增加;SEM觀察可見BMSCs緊密粘附在支架纖維表面;RT-PCR的結果顯示:定向誘導分化培養(yǎng)的“細胞-支架復合物”中，可檢測到α-MHC、GATA-4表達，其表達量分別與“竹節(jié)樣”和“肌管樣”結構階段相當