大鼠晶狀體再生模型中干細(xì)胞樣細(xì)胞及其相關(guān)信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、摘要目的：改進(jìn)大鼠晶狀體再生模型，觀察晶狀體再生過程中干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，并初步探討Notch信號(hào)通路在晶狀體干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖分化中的作用。方法：。第一部分：大鼠晶狀體再生模型的改進(jìn)對(duì)68周成年健康Wistar大鼠一眼采用透明角膜切口行晶狀體囊外摘除術(shù)，術(shù)中不采用環(huán)形撕囊，而只將晶狀體前囊膜做騶象限的弧形切開，分離出晶狀體。術(shù)后即刻、1天、3天、1周、2周、1月，分別裂隙燈下觀察晶狀體再生情況并照相，HE染色行病理組織學(xué)檢查。第二部分：

2、晶狀體再生過程中干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)及定位1將晶狀體囊外摘除術(shù)后3天、1周、2周及1月的晶狀體再生組織分別取出，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過熒光定量PCR的方法檢測再生組織中干細(xì)胞標(biāo)記物ABCG2、Nestin、PCNA及Telomerase的表達(dá)，確定再生晶狀體組織中干細(xì)胞樣細(xì)胞是否存在。設(shè)對(duì)側(cè)未手術(shù)眼為正常對(duì)照。2晶狀體囊外摘除術(shù)后即刻，將晶狀體囊袋組織分為前囊及后囊(包含赤道部)兩部分，分別提取RNA并通過熒光定量PCR的

3、方法檢測各部分干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，初步定位晶狀體干細(xì)胞樣細(xì)胞。3石蠟包埋的大鼠眼作厚度為4微米的石蠟切片，免疫組化檢測ABCG2及PCNA的表達(dá)，對(duì)晶狀體干細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)一步定位。4晶狀體囊外摘除術(shù)前3天每天兩次注射BrdU，最后一次注射后行一眼的晶狀體囊外摘除術(shù)，術(shù)后即刻、術(shù)后l天、3天及l(fā)周分別取眼球石蠟包埋后切片，通過免疫組化的方法檢測BrdU的表達(dá)，確定增殖的細(xì)胞所在，輔助定位晶狀體干細(xì)胞樣細(xì)胞。第三部分：Notch信號(hào)通路與晶狀

4、體再生1將晶狀體囊外摘除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的晶狀體再生組織取出，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過熒光定量PCR的方法檢測Notch信號(hào)通路信號(hào)分子Notchl、Notch2及Ja91的表達(dá)，并且通過對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinDl的PCR檢測，初步驗(yàn)證此信號(hào)通路是否存在于晶狀體再生過程中。2晶狀體囊外摘除術(shù)后即刻、3天及1周，將再生晶狀體組織取出，分別提取組織蛋白，通過Westernblot的方法檢測各部分組織中Notchl、Not

5、ch2及Jagl的表達(dá)及變化。結(jié)果：及Notch配體Jagl的表達(dá)，且晶狀體囊外摘除術(shù)后早期表達(dá)量呈上升趨勢，術(shù)后1周表達(dá)量最高，之后逐漸降低。而相應(yīng)的細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵蛋白CyclinDl的表達(dá)趨勢與此類似。根據(jù)PCR結(jié)果，選取術(shù)后l周內(nèi)的晶狀體再生組織行Westernblot檢測，結(jié)果顯示術(shù)后即刻即有Notch2的表達(dá)，術(shù)后3天Notch2表達(dá)明顯，術(shù)后1周表達(dá)降低，而Notchl術(shù)后l周表達(dá)明顯。Jagl在術(shù)后3天開始表達(dá)，術(shù)后1周

6、表達(dá)量明顯。但作為對(duì)照的正常晶狀體組織未檢測到各信號(hào)分子蛋白的表達(dá)。結(jié)論：l改進(jìn)的大鼠晶狀體再生模型短期內(nèi)即可再生出新的晶狀體組織，且遠(yuǎn)離前囊切開的部分再生組織較透明，相應(yīng)地晶狀體上皮細(xì)胞排列較規(guī)則。而前囊切開部分的晶狀體組織明顯混濁，相應(yīng)晶狀體上皮細(xì)胞異常增生，未發(fā)生晶狀體纖維化改變。2正常晶狀體及再生晶狀體組織中均存在干細(xì)胞樣細(xì)胞，其在晶狀體再生過程中發(fā)揮重要作用。正常的晶狀體組織內(nèi)僅少量的干細(xì)胞樣細(xì)胞存在，以維持晶狀體的自我更新；