記憶提取誘發(fā)杏仁體基底外側核的蛋白降解在線索性恐懼記憶擦除過程中的作用.pdf

1、一、研究背景
　　經(jīng)典的巴甫洛夫恐懼記憶條件反射模型（Pavlovianfearconditioning）的建立是通過一個無害的刺激，即條件性刺激(conditionedstimulus,CS)，如聲音，光線，環(huán)境等和一個先天的厭惡性非條件刺激(unconditionedstimulus，US)如足底電擊建立條件反射來實現(xiàn)的。條件反射建立穩(wěn)定之后，如果給予動物反復的CS刺激，又會使得動物覺得偶聯(lián)的CS無害，導致恐懼記憶漸進性減弱，

2、從而造成記憶的消退(extinction)。但消退不是永久性的，消退的記憶會被一些自發(fā)因素再次喚起，這提示消退可能并不是直接對原有記憶的修改，而是通過形成一個新的記憶來抑制原有的記憶的激活。這種對原有記憶的抑制是和消退訓練時的時空環(huán)境以及動物的感覺緊密相關的，人類和嚙齒類動物相似，都會在三種普遍的情況下發(fā)生消退后的記憶的再度出現(xiàn)。這三種情況是:(1)更新(renewal)，當CS在消退環(huán)境外的環(huán)境出現(xiàn)時會發(fā)生;(2)復原(reinsta

3、tement)，當原始的US再次出現(xiàn)時發(fā)生;(3)自發(fā)恢復(spontaneousrecovery)，當消退后經(jīng)歷一定時間后會出現(xiàn)。當前在臨床治療上，基于消退訓練的暴露療法廣泛地應用于許多病態(tài)記憶的治療中，例如創(chuàng)傷后應激綜合癥、恐懼癥等等。這些治療方法在某些方面是有效的，但是并不適用與任何人，部分患者會由于更新、復原或自發(fā)恢復而導致病情的復發(fā)。
　　以往的研究表明，記憶的再鞏固后會有一個記憶變的不穩(wěn)定的時間窗。近來的研究表明，將記

4、憶提取(retrieval)出來，并在提取后的時間窗內(nèi)進行記憶的消退訓練有擦除記憶的作用，從而抑制了原有記憶的喚起。也就是說，用之前和足底電擊偶聯(lián)在一起的CS將記憶提取出來（即retrieval），10min或1小時之后進行消退訓練，可以有效地擦除恐懼記憶的更新、復原和自發(fā)恢復（6小時以后則會失效）。這種記憶提取-消退模型是可以消除原有記憶復發(fā)的一個有效模型，而且已經(jīng)證明這種模型不僅在恐懼記憶中存在，在成癮記憶中也存在，并且擦除效果在嚙

5、齒類和人類身上都有效。然而這種記憶擦除模型具有一定的局限性:有研究報道在記憶鞏固完成一個月之后再用Retrieval+Extinction模型就無法擦除記憶;并且這種擦除模型限定條件較多，如果更改模型中的一些條件，則記憶擦除就有可能會失敗。因此，找到記憶擦除的機制，并針對介導記憶擦除的關鍵性位點進行干預，將為我們對相關基本疾病的治療（如創(chuàng)傷后應激綜合癥等）的應用大有裨益。
　　突觸在動物的學習記憶過程中會發(fā)生一系列的形態(tài)學和功能上

6、的變化，這些變化是依賴與蛋白合成與蛋白降解的共同作用的。目前針對蛋白合成與學習記憶的關系研究的較為透徹，但對蛋白降解在學習記憶作用卻研究很少。真核細胞的蛋白降解是一個動態(tài)且復雜的過程，泛素蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasomesystem，UPS)在這個過程中扮演著重要的角色。有研究表明，在伏核核部(nucleusaccumbens，NAc)注射蛋白酶體抑制劑可以破壞可卡因獎勵記憶的消退，但明確的關于蛋白降解是否參與線索

7、性條件性恐懼記憶中的聲音誘導的條件性恐懼記憶模型(Auditoryfearconditioning，AFC)的消退還沒有報道。此外，最新的研究表明，在環(huán)境誘導的條件性恐懼記憶模型中，海馬CA1腦區(qū)中的多泛素化水平會在記憶提取之后升高。聯(lián)系之前的研究，我們可以提出假設，是否記憶提取之后蛋白降解水平的升高介導了記憶的擦除過程？在這篇文章中，我們采用聲音誘導的條件性恐懼記憶模型研究了記憶擦除的機制。我們發(fā)現(xiàn)在大鼠的杏仁體基底外側核(basol

8、ateralamygdala，BLA)中，蛋白酶體系統(tǒng)介導的蛋白降解在記憶擦除中扮演著重要角色。
　　二、研究目的
　　研究蛋白降解在記憶擦除中的作用并初步探討其機制。
　　三、實驗結果
　　1.在BLA注射蛋白酶體活性抑制劑βLac對AFC記憶消退的影響
　　在雙側BLA注射蛋白酶體的抑制劑βLac0.5hr后進行消退訓練，24小時后檢測LTM，評價其對大鼠AFC記憶消退的影響。與溶劑對照組相比，實驗組的

9、Freezing值與對照組無明顯差異。
　　2.βLac抑制retrieval對AFC記憶消退自發(fā)恢復的擦除
　　所有的動物在經(jīng)歷三次CS-US偶聯(lián)刺激之后分為三組:retrieval后消退組（Ret組），注射βLac后retrieval并消退組（Ret+βLac組)以及noretrieval消退組（NoRet組）。三組注射溶劑或者βLac30min后進行retrieval或者noretrieval訓練，1hr之后對動物進行

10、消退訓練，24小時后檢測LTM，在LTM測試兩周后檢測動物的自發(fā)恢復情況。結果顯示，三組間的LTM和extinction結果均無差異(ANOVA，p＞0.1);和Ret組相比，NoRet組和Ret+βLac組自發(fā)恢復的freezing值明顯升高，并且兩組間無差異。這說明retrieval后的蛋白降解是AFC記憶消退自發(fā)恢復的擦除所必需的。
　　3.βLac抑制retrieval對AFC記憶消退更新的擦除
　　在做renewa

11、l實驗時，動物在A環(huán)境建立條件反射之后同樣分為三組:Ret組、Ret+βLac組以及NoRet組。三組的腦內(nèi)給藥方式及retrieval或者noretrieval方式同上，區(qū)別之處在于在B環(huán)境進行。三組retrieval或者noretrieval后在B環(huán)境做消退訓練，24小時后在B環(huán)境檢測LTM。在LTM測試24小時后，將所有動物放置回A環(huán)境檢測動物的記憶renewal情況時，我們發(fā)現(xiàn)和Ret組相比，NoRet組和Ret+βLac組re

12、newal的freezing值明顯升高，并且兩組間無差異。
　　4.βLac抑制retrieval對AFC記憶消退復原的擦除
　　對于reinstatement實驗，所有的實驗都在同一環(huán)境下進行。三組的腦內(nèi)給藥方式及retrieval或者noretrieval方式同上。所有的三組動物在經(jīng)歷了相同水平的條件反射建立和消退訓練之后，動物再次暴露于相同環(huán)境下承受5次US刺激（此過程中無CS出現(xiàn)）。再過24hr之后，通過4次CS刺激

13、檢測動物的reinstatement情況時發(fā)現(xiàn)與各自的最后四次extinctionCS相比，NoRet組和Ret+βLac組的freezing水平都有所增加，而Ret組無變化。
　　5.Retrieval后泛素化介導的蛋白降解增加介導消退記憶的擦除
　　動物分五組:NoRetrieval后一小時取材組（NoRet組）;NoRetrieval后1小時進行消退訓練，訓練后立即取材組（NoRet+Ext組）;Retrieval后一

14、小時取材組（Ret1hr組）;Retrieval后1小時進行消退訓練，訓練后立即取材組（Ret+Ext組）;Retrieval后2小時取材組（Ret2hr組）。取材部位為BLA。GST-S5a多泛素化分析實驗結果表明，NoRet組與Ret2hr組的多泛素化水平都高;NoRet組與NoRet+Ext組相比多泛素化水平?jīng)]有明顯變化;Ret+Ext組多泛素化水平與NoRet+Ext組有明顯升高。
　　四、實驗結論
　　我們首次發(fā)現(xiàn)