乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠和多器官障礙綜合征模型的評(píng)價(jià)及藥物干預(yù)研究.pdf

1、乙型肝炎作為一種世界性的傳染病,尚無(wú)徹底根治的辦法。乙肝病毒(HBV)的宿主特異性給乙肝疾病模型的建立帶來(lái)了很大難度。目前的乙肝動(dòng)物模型局限性在于所用動(dòng)物與人類相比在進(jìn)化上相去甚遠(yuǎn),而一般的哺乳動(dòng)物又很難感染HBV。因此,建立一種穩(wěn)定可靠的乙肝動(dòng)物模型對(duì)乙肝發(fā)生機(jī)制的研究和抗乙肝藥物的篩選具有重要意義。多器官功能障礙綜合征(MODS)作為一種臨床致死率較高的疾病,其發(fā)病機(jī)制尚無(wú)定論,目前普遍認(rèn)為與機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞損傷所釋放的內(nèi)毒素導(dǎo)致多個(gè)器

2、官功能障礙有關(guān)。臨床上降低MODS死亡率的手段主要是積極干預(yù)各種會(huì)引起感染性休克的因素。而許多抗炎保肝天然產(chǎn)物,能有效抑制機(jī)體炎癥和內(nèi)毒素產(chǎn)生,緩解器官的病理?yè)p傷。
　　本課題第一部分以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠作為研究對(duì)象,首先驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因小鼠HBV DNA的復(fù)制和HBV抗原的表達(dá)情況,然后在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)抗乙肝研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型,探討了松果菊苷對(duì)HBV復(fù)制的影響。第二部分采用頸動(dòng)脈穿刺放血和尾靜脈注射脂多糖兩次打擊

3、的方法,建立SD大鼠多器官功能障礙綜合征模型,并運(yùn)用該模型探討了具有抗炎保肝作用的六棱菊提取物(LAE)對(duì)實(shí)驗(yàn)性多器官障礙綜合征的改善作用。
　　一、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠病毒表達(dá)特性及松果菊苷抗HBV作用研究
　　1. HBV轉(zhuǎn)基因小鼠病毒表達(dá)特性研究
　　HBV轉(zhuǎn)基因小鼠源自正常小鼠受精卵經(jīng)顯微注射整合人類HBV全基因組后培育而成。為了評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制情況,抽提轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織和尾巴組織DNA,采用熒光定量

4、PCR方法擴(kuò)增檢測(cè)HBV DNA水平,并采用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清乙肝表面抗原(HBsAg)和E抗原(HBeAg)水平。通過(guò)檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶(GOT/GPT)水平和肝組織病理變化,了解轉(zhuǎn)基因小鼠的肝功能狀況。結(jié)果表明:HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織和血清HBV DNA水平在2.0×103~1.0×107 copies/ml之間;血清HBsAg和HBeAg呈陽(yáng)性;轉(zhuǎn)基因小鼠血清GOT和GPT水平明顯高于正常小鼠;肝組織病理學(xué)檢查顯示病理學(xué)檢查顯

5、示局部細(xì)胞形態(tài)和排列出現(xiàn)輕微改變,肝動(dòng)靜脈有擴(kuò)張趨勢(shì),與轉(zhuǎn)氨酶的升高相吻合。上述結(jié)果表明,HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制呈活躍狀態(tài),能夠在一定程度上模擬乙肝患者HBV的復(fù)制,可作為抗乙肝藥物評(píng)價(jià)的疾病模型。
　　2.松果菊苷體內(nèi)外抗HBV作用研究
　　松果菊苷對(duì) HepG2.2.15細(xì)胞 HBV表達(dá)的影響:以 HBV基因轉(zhuǎn)染的HepG2.2.15細(xì)胞為模型,研究松果菊苷的體外抗HBV作用。將HepG2.2.15細(xì)胞接種于9

6、6孔板,每孔加入含不同濃度(100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml和1μg/ml)松果菊苷和陽(yáng)性藥物拉米夫定的DMEM培養(yǎng)基,每種濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔。在37℃下培養(yǎng)3和6天后,采用ELISA法測(cè)定HBsAg和HBeAg水平;采用熒光定量PCR法測(cè)定HBV DNA水平。結(jié)果表明:松果菊苷作用HepG2.2.15細(xì)胞6天后,在50和100μg/ml濃度下能顯著抑制HBsAg和HBeAg表達(dá),其最高抑制率分別為42.68

7、％和46.29%;同時(shí)對(duì)HBV DNA也具有抑制作用。
　　松果菊苷對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBV表達(dá)的影響:以HBV轉(zhuǎn)基因小鼠為模型,研究松果菊苷的體內(nèi)抗HBV作用。將40只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為5組:對(duì)照組、拉米夫定(50 mg/kg)組、大劑量松果菊苷(50 mg/kg)組、中劑量松果菊苷(25 mg/kg)組和小劑量松果菊苷(12.5 mg/kg)組。每天灌胃給藥1次,對(duì)照組小鼠給予等劑量的生理鹽水,連續(xù)給藥30天。第31天小

8、鼠眼眶取血,分離血清分別檢測(cè)HBV DNA、HBsAg、HBeAg、GOT和GPT水平;解剖取其肝臟,提取肝組織DNA并測(cè)定其HBV DNA水平,同時(shí)制作肝組織病理學(xué)檢查。結(jié)果表明:50mg/kg劑量對(duì)血清HBV DNA有顯著抑制作用,但各劑量對(duì)肝組織HBV DNA水平均無(wú)顯著性影響。
　　上述結(jié)果表明,松果菊苷具有較明顯的體內(nèi)外抗HBV作用。
　　二、多器官功能障礙綜合征(MODS)模型的建立及其藥物干預(yù)研究
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9、. MODS大鼠模型的建立
　　選取雄性SD大鼠,體重在150-180 g之間。動(dòng)物在建模前12小時(shí)開(kāi)始禁食,以3%的戊巴比妥鈉1ml/kg體重腹腔注射麻醉;用一次性針筒抽取大鼠頸部動(dòng)脈竇血液2 ml,對(duì)大鼠造成失血性休克創(chuàng)傷;放血后用生理鹽水3.5 ml/kg體重灌胃;再經(jīng)12小時(shí)后,尾靜脈注射7 ml/kg脂多糖(LPS),造成二次內(nèi)毒素刺激;然后每天用生理鹽水灌胃,連續(xù)三天。三天后從未死亡的造模大鼠中挑選符合多器官障礙體征的

10、大鼠,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.六棱菊提取物(LAE)對(duì)MODS的干預(yù)作用研究
　　取MODS大鼠32只,隨機(jī)分為4組:模型組,LAE大劑量(100 mg/kg)組、LAE中劑量(50 mg/kg)組和LAE小劑量(25 mg/kg)組,試藥組以不同劑量的LAE每天灌胃,模型組給予等劑量的生理鹽水。連續(xù)給藥10天后,采取大鼠血液分離血清,測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、B型鈉尿肽(BNP)、一氧化氮(NO)、肌酸激酶同工酶M

11、B(CK-MB)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、尿素氮(BUN)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和內(nèi)毒素含量。結(jié)果顯示LAE對(duì)炎癥相關(guān)介質(zhì)具有顯著抑制作用,能有效緩解大鼠體內(nèi)炎癥,減少機(jī)體自由基,顯著改善心功能和肝功能。說(shuō)明LAE對(duì)MODS具有明顯改善作用。
　　綜上所述,本論文研究了HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的病毒表達(dá)特性,并采用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,證明了松果菊苷的抗HBV作用;同時(shí)通過(guò)建立的MODS大鼠模型,探討了LAE對(duì)MODS的改善作用。有