2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:建立一種新的采用酸化玻璃珠法分離純化質(zhì)粒DNA-蛋白復(fù)合物的方法,從pGL3-Control vector瞬時轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中分離SV40啟動子的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物,進(jìn)而通過SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)和快速銀染色,初步分離純化SV40啟動子相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,為進(jìn)行肽質(zhì)譜法分析鑒定轉(zhuǎn)錄因子奠定實驗基礎(chǔ)。
   方法:⑴在宿主菌中轉(zhuǎn)化和大量擴(kuò)增pGL3-Control vector,制備足夠的高純度pGL3-Control v

2、ector。⑵以pGL3-Control vector瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,優(yōu)化質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后在細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)的時間。⑶甲醛交聯(lián)質(zhì)粒DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體,以甘氨酸終止交聯(lián)。⑷凍融法制備細(xì)胞裂解物,采用酸化玻璃珠法從細(xì)胞裂解物中分離純化出質(zhì)粒DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體。⑸質(zhì)粒DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體解交聯(lián)獲得結(jié)合蛋白(即為SV40啟動子的轉(zhuǎn)錄因子)。⑹丙酮沉淀蛋白,行蛋白SDS-PAGE,通過考馬斯亮藍(lán)染色和快速銀染色觀察結(jié)合蛋白在膠中的分

3、離情況。⑺后期將會進(jìn)行蛋白復(fù)合物的2-D PAGE及肽質(zhì)譜法分析鑒定SV40啟動子的轉(zhuǎn)錄因子種類。
   結(jié)果:①pGL3-Control vector在293T細(xì)胞中可以高度表達(dá)熒光素酶蛋白,在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后不同時間點上檢測各組細(xì)胞的熒光素酶蛋白表達(dá)量,確定了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后高度表達(dá)的時間優(yōu)化結(jié)果為40h左右。②通過反復(fù)凍融法可以獲得大量的細(xì)胞裂解物,并采用酚氯仿法從細(xì)胞裂解物中成功地抽提到pGL3-Control vector,質(zhì)粒P

4、CR擴(kuò)增后鑒定效果好。③通過甲醛交聯(lián)pGL3-Control vector DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體和酸化玻璃珠纏繞法成功地從細(xì)胞裂解物中分離純化出質(zhì)粒DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體。④pGL3-Control vector DNA-結(jié)合蛋白復(fù)合體經(jīng)解交聯(lián)和丙酮沉淀后,行蛋白復(fù)合物SDS-PAGE,可以明顯看到不同分子水平的蛋白條帶,且大分子條帶居多。⑤收集6平皿(100mm直徑的細(xì)胞培養(yǎng)皿)細(xì)胞,反復(fù)凍融法裂解后通過以上方法獲得蛋白復(fù)合物,經(jīng)過

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