人熱休克轉(zhuǎn)錄因子1dbd基因的克隆表達(dá)及純化.pdf

1、熱休克蛋白(heatshockprotein，HSPs)在細(xì)胞中行使重要功能，它可幫助新生蛋白的轉(zhuǎn)移和折疊、變性蛋白的重折疊、蛋白寡聚物重新整合以保護(hù)細(xì)胞免受外界脅迫條件導(dǎo)致的損傷等。其中最主要的熱休克蛋白是熱休克蛋白70(heatshockprotein70,HSP70)。HSP70的基因表達(dá)是受熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heatshocktranscriptionfactor1,HSF1)調(diào)控的，外界信號(hào)刺激活化HSF1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(

2、DNA-bindingdomain，DBD)，使其結(jié)合熱休克基因的啟動(dòng)子-熱休克原件(heatshockelement，HSE)序列，誘導(dǎo)Hsps的表達(dá)。在未發(fā)生熱刺激或其它壓力脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)維持著一定量的HSP70表達(dá)水平，HSF1的無活性單體與HSP70結(jié)合形成復(fù)合體。隨著熱刺激或其它外界壓力的脅迫，目前尚不清楚的信號(hào)通路誘導(dǎo)了HSF單體-HSP70復(fù)合體的解離，同時(shí)還觀察到HSBP1與HSF1三聚體的復(fù)合物形成。當(dāng)熱應(yīng)激減弱時(shí)，H

3、SBP1又與HSP70發(fā)生相互作用生成了HSBP1-HSP70復(fù)合物。 為了獲得大量熱休克轉(zhuǎn)錄因子1DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(heatshocktranscriptionfactor1DNA-bindingdomain，DBD)蛋白用于晶體生長進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)解析，本研究將dbd基因片段克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中并獲得高效表達(dá)，經(jīng)過GlutathioneSepharoseTM4B親和層析、ResourceQ純化后，蛋白純度達(dá)到

4、95％以上。通過圓二色譜儀分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示α螺旋占33％，β折疊占15％。純化的蛋白質(zhì)與同源性達(dá)68％的Kluyveromyceslactis的DBD有相似的空間構(gòu)象。采用懸滴氣相擴(kuò)散法得到了針狀DBD晶體。獲得的晶體為進(jìn)一步進(jìn)行蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)解析奠定了基礎(chǔ)。 另外研究表明HSP70并不具備類似于HSF1三聚化結(jié)構(gòu)域，因此對(duì)HSBP1-HSP70相互作用的研究能揭示蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)特異的新型結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)原核