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文檔簡介
1、目的:1.探討SAD大鼠微循環(huán)異常在左心室肥厚中的作用;2.研究體外壓力波動(dòng)對血小板的活化作用。 方法:1.將Sprague-Dawley(SD)大鼠行SAD:大鼠麻醉后,緊貼迷走神經(jīng)切斷喉上神經(jīng)約5mm,隨之從頸動(dòng)脈鞘中仔細(xì)分離出頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)干,將剩下的組織(含主動(dòng)脈神經(jīng),交感干及動(dòng)脈鞘組織)一并切斷約5mm。然后分離摘除頸上神經(jīng)節(jié),再分離頸總動(dòng)脈分叉處血管外周組織,使頸總動(dòng)脈,頸內(nèi)動(dòng)脈,頸外動(dòng)脈,枕動(dòng)脈完全游離約5mm
2、,用少量10%苯酚乙醇溶液涂擦創(chuàng)面。術(shù)后動(dòng)物隨機(jī)分為2、4、8和16周組,在清醒自由活動(dòng)狀態(tài)下,應(yīng)用MPA生物信號(hào)記錄系統(tǒng)檢測動(dòng)脈血壓及血壓波動(dòng)性和壓力感受性反射功能的變化;2.另將SD大鼠行SAD,術(shù)后動(dòng)物隨機(jī)分為2、4、8和16周組,同時(shí)設(shè)尼群地平治療組(SAD+Nit),SAD術(shù)后喂食含尼群地平的藥飼料16周,劑量10mg/kg/d。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)稱重,取血,計(jì)數(shù)血細(xì)胞,檢測血液流變學(xué),應(yīng)用灌流小室技術(shù)在血液流動(dòng)狀態(tài)下測定血小板粘
3、附率的變化,共聚焦技術(shù)測定血栓高度,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板表面P-選擇素的表達(dá),應(yīng)用ELISA和硝酸還原酶法分別測定血漿vWF、VEGF和NO的含量。取左心室心肌組織行病理學(xué)檢查和VG染色,應(yīng)用堿性磷酸酶染色檢測毛細(xì)血管密度,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR和western印跡法,檢測VEGF、Flt-1、Flk-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。用相關(guān)分析方法研究左心室肥厚指標(biāo)與微循環(huán)異常參數(shù)之間的關(guān)系;3.血液在微量注射/抽吸泵吸引下注入灌流小室,每間
4、隔15秒鐘,在低血流(581μl/min,切變率300S-1)與高血流(252μl/min,切變率1300S-1)交替變換一次,建立血流波動(dòng)模型,并應(yīng)用激光多普勒血流儀實(shí)時(shí)監(jiān)測灌流小室血流變化,血流波動(dòng)性以5min內(nèi)血流量變化的標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用灌注小室、膠原或vWF粘附表面,在低血流量(58μl/min,切變率300S-1)、高血流量(252μl/min,切變率1300S-1)和血流波動(dòng)狀態(tài)灌流5分鐘,測定血小板的粘附率。同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)
5、胞術(shù)檢測血液灌流前后,血小板表面P-選擇素和PAC-1的表達(dá)。應(yīng)用MPA生物信號(hào)記錄系統(tǒng),實(shí)時(shí)測定低血流量、高血流量和血流波動(dòng)狀態(tài)壓力和壓力波動(dòng)性的變化,并分別與血流和血流波動(dòng)性進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果:1.SAD大鼠血流動(dòng)力學(xué)和動(dòng)脈壓力感受性反射功能變化特征 (1)與假手術(shù)組比較,SAD 2、4、8和16周大鼠SBP、DBP、MBP、HR、HRV無明顯差別,但其SBPV、DBPV和MBPV均顯著增高,提示SAD大鼠呈現(xiàn)出單純BP
6、V增高的表現(xiàn);(2)SAD 2、4、8和16周大鼠對去氧腎上腺素的升壓反應(yīng)無明顯差別,但其心率減慢作用顯著降低,表明SAD后大鼠動(dòng)脈壓力感受性反射功能明顯受損。2.SAD大鼠左心室大體形態(tài)結(jié)構(gòu)基本改變與相應(yīng)假手術(shù)組比較,SAD2、4、8和16周大鼠的體重顯著減輕。SAD4周、8周和16周大鼠心臟重量、心臟重量指數(shù)(心臟重/體重)、左心室重量、左心室重量指數(shù)(左心室重/體重)和左心室壁厚均顯著增加。左心室組織切片染色顯示心肌肥大、斷裂、壞
7、死和膠原纖維增加,左心室膠原容積分?jǐn)?shù)和心肌橫截面積也顯著增加。表明SAD4周后大鼠存在左心室肥厚。3.SAD大鼠微循環(huán)的變化 (1)與相應(yīng)假手術(shù)組比較,SAD 2、4、8和16周大鼠血漿中vWF和VEGF含量顯著增高,左心室VEGFmRNA和蛋白表達(dá)上調(diào),血漿NO水平顯著降低,提示SAD大鼠存在血管內(nèi)皮功能的異常。(2)與相應(yīng)假手術(shù)組比較,SAD4周、8周和16周大鼠左心室心肌毛細(xì)血管密度顯著降低。(3)與相應(yīng)假手術(shù)組比較,SAD2周至
8、16周大鼠,左心室Flk-1 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào),但Flt-1 mRNA和蛋白表達(dá)無顯著變化。(4)與相應(yīng)假手術(shù)組比較,SAD 2、4、8和16周大鼠紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)無明顯差異,但血小板體積、大血小板比率和血小板分布寬度明顯增加,提示存在血小板異常。(5)與假手術(shù)組比較,SAD 2、4、8和16周大鼠,在剪切率1 s-1、30 s-1、200 s-1時(shí)全血粘度均顯著增高,血漿粘度也顯著增高,在剪切率300s-1時(shí)血小板粘附
9、率和血栓高度顯著增加,血小板表面P-選擇素表達(dá)陽性率顯著上升,提示SAD大鼠微循環(huán)管內(nèi)因素的異常。4.尼群地平對SAD大鼠左心室肥厚及微循環(huán)的影響 (1)與相應(yīng)SAD16周大鼠相比,應(yīng)用16周尼群地平使大鼠心臟重量指數(shù)、左心室重量指數(shù)、左心室壁厚、左心室膠原容積分?jǐn)?shù)和心肌橫截面積均顯著降低。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn),應(yīng)用尼群地平大鼠心肌細(xì)胞腫脹和肥大明顯減輕,膠原纖維減少。提示尼群地平對SAD大鼠左心室肥厚有改善作用。(2)與SAD16周大鼠
10、相比,應(yīng)用尼群地平大鼠血漿vWF和VEGF含量顯著降低,左心室VEGF mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),血漿NO水平顯著升高。提示尼群地平能夠保護(hù)SAD大鼠內(nèi)皮細(xì)胞功能。(3)尼群地平顯著增高左心室毛細(xì)血管密度,導(dǎo)致左心室Flk-1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),對Flt-1mRNA和蛋白表達(dá)無影響。(4)尼群地平顯著降低SAD大鼠血小板體積、大血小板比率和血小板分布寬度,顯著降低全血粘度、血漿粘度、血小板粘附率和血栓高度,使血小板表面P-選擇素陽性
11、表達(dá)率顯著減少。提示尼群地平能夠改善SAD大鼠血液粘度的異常,降低血小板的粘附聚集功能。5.左心室肥厚與微循環(huán)異常因素之間的關(guān)系對SAD大鼠進(jìn)行相關(guān)分析結(jié)果表明,作為左心室肥厚指標(biāo)的左心室重量指數(shù)(左心室重/體重)、左心室壁厚、左心室膠原容積分?jǐn)?shù)、左心室心肌橫截面積,均與血漿NO、左心室毛細(xì)血管密度負(fù)相關(guān),而與血漿vWF、血漿和左心室VEGF蛋白水平、P-選擇素陽性百分率、血液粘度正相關(guān)。6.體外壓力波動(dòng)對血小板功能的影響 (1)多普勒
12、血流儀監(jiān)測結(jié)果表明,血流波動(dòng)狀態(tài)的血流量(58μl/min,切變率300S-1)比低血流量時(shí)顯著增加,比高血流量(252μl/min,切變率1300S-1)時(shí)顯著減少,但血流波動(dòng)狀態(tài)時(shí)的血流波動(dòng)性比高血流量時(shí)和低血流量時(shí)顯著增高,提示血流波動(dòng)模型成功。(2)高血流量時(shí)血小板對膠原蛋白和vWF的粘附率比低血流量時(shí)顯著增加,血流波動(dòng)狀態(tài)血小板對膠原蛋白和vWF的粘附率比高、低血流量時(shí)均顯著增加。經(jīng)膠原蛋白和vWF粘附表面灌流后,與灌流前血液
13、相比,血流波動(dòng)狀態(tài)下血小板表面P-選擇素的表達(dá)顯著增高,高、低血流量狀態(tài)下,血小板表面P-選擇素的表達(dá)無顯著變化。在三種血流狀態(tài)下,血小板表面PAC-1表達(dá)也均無顯著變化。(3)血流波動(dòng)狀態(tài)時(shí)灌流小室內(nèi)壓力比低血流量時(shí)顯著增加,比高血流量時(shí)顯著減少;但血流波動(dòng)狀態(tài)時(shí)的壓力波動(dòng)性比高血流量和低血流量時(shí)均顯著增加。灌流小室壓力與小室血流量之間、壓力波動(dòng)性與小室血流波動(dòng)性之間都具有顯著正相關(guān)性,提示體外血流模型中波動(dòng)血流呈現(xiàn)壓力波動(dòng)狀態(tài),體外
14、血流模型即為壓力波動(dòng)模型。從壓力波動(dòng)性的角度來看,壓力波動(dòng)性增高能夠活化血小板,可能與引起血流波動(dòng)而直接激活血小板有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論: 結(jié)論:1.血壓波動(dòng)性增高較早期導(dǎo)致左心室微循環(huán)的異常,以血管內(nèi)皮細(xì)胞損害、血液粘度增高和毛細(xì)血管密度減少為特征,隨后左心室肥厚出現(xiàn),這些變化出現(xiàn)后即持續(xù)存在;2.壓力波動(dòng)產(chǎn)生的機(jī)械刺激能夠激活血小板,血小板活化是血壓波動(dòng)性增高導(dǎo)致微循環(huán)異常的機(jī)制之一;3.微循環(huán)異常是血壓波動(dòng)性增高導(dǎo)致左心室肥厚的原
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