維A酸和涼血活血復方及黃芪注射液治療銀屑病的臨床及實驗研究.pdf

1、背景：銀屑病是常見的慢性炎癥性、增殖性皮膚病，頑固、難治、易復發(fā)，目前尚缺乏理想的治療方法。維A酸類藥物是目前治療銀屑病的主要用藥之一，臨床療效確切，但其抗病機制尚不完全明了，該藥因嚴重的毒副作用限制了臨床應用；中藥治療銀屑病在我國歷史悠久，主要治則是涼血、活血等。我院應用于銀屑病的涼血活血復方秉承了傳統(tǒng)中醫(yī)理論及中醫(yī)驗方，具有涼血、活血、祛風、理濕等功效，經動物實驗和初步的臨床研究證實對銀屑病有較好療效。黃芪注射液含有黃芪的主要有效成

2、分，現(xiàn)代藥理學研究表明具有免疫增強和免疫調節(jié)作用。以往研究證明治療銀屑病有效，但其抗病機制尚不完全明了。 目的：本研究旨在比較維A酸類藥物和傳統(tǒng)中藥方劑的臨床療效，并觀察不同的維A酸類藥物及中藥復方和黃芪注射液聯(lián)合應用對療效的影響。在此基礎上考查第二代維A酸(依曲替酸)和傳統(tǒng)中藥提取物黃芪注射液對體外培養(yǎng)的永生化人角質形成細胞株(HaCaT細胞)的增殖、凋亡及維生素D受體(VDR)表達的影響，探索銀屑病的發(fā)病機制，明確維A酸類藥

3、物治療銀屑病的可能機制。同時對比分析維A酸類藥物和傳統(tǒng)中藥的作用機理，為維A酸類藥物與中藥聯(lián)合應用提供實驗依據(jù)。 方法：(1)臨床研究：選擇經臨床檢查或皮膚病理活檢確診的銀屑病患者272例，按入院或接診時間分為三個治療組。芳香維A酸乙酯治療組41例口服芳香維A酸乙酯膠囊，依曲替酸治療組66例口服依曲替酸膠囊，中藥涼血活血復方治療組165例口服涼血活血復方煎劑。同時各組內設部分患者聯(lián)合應用黃芪注射液。采用國際通用的銀屑病皮損嚴重程

4、度評分(PASI)法判定臨床療效，對各組間的療效進行比較，同時對各組內應用黃芪注射液者與未用者之間的療效進行統(tǒng)計學分析。(2)實驗研究：免疫組化法觀察銀屑病皮損和正常表皮角質形成細胞VDR蛋白表達情況，鏡下計數(shù)陽性反應細胞數(shù)，采用半定量方法評價陽性反應程度，比較銀屑病皮損和正常表皮VDR表達有無差異：將不同濃度的依曲替酸或黃芪注射液分別作用于體外培養(yǎng)的HaCaT細胞24h、48h、72小時。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法(MTT)檢

5、測藥物對細胞增殖的影響，計算生長抑制率及IC50；根據(jù)MTT結果分別選定兩種藥物適宜的作用濃度及時間作用于HaCaT細胞，流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡。于透射電鏡下觀察凋亡細胞形態(tài)，研究依曲替酸和黃芪注射液對HaCaT細胞周期及凋亡的影響；采用Western印記法半定量檢測HaCaT細胞VDR蛋白表達水平，以陰性對照組VDR蛋白表達作為基準，計算各用藥組VDR蛋白表達量的變化情況；Real-Time RT-PCR方法分析HaCaT細胞V

6、DR mRNA相對表達量。 結果：①芳香維A酸乙酯治療組、依曲替酸治療組、中藥涼血活血復方治療組的總有效率分別為82.9％、78.8％和64.2％：各治療組內聯(lián)合應用黃芪治療者有效率均高于未用黃芪者；芳香維A酸乙酯組和依曲替酸組的總有效率明顯高于中藥涼血活血復方組，芳香維A酸乙酯組和依曲替酸組間療效沒有顯著性差異。②依曲替酸和黃芪均對HaCaT細胞增殖有明顯的抑制作用，作用24、48、72小時，依曲替酸抑制HaCaT細胞增殖的I

7、C50分別為47.80μg/ml、27.40μg/ml、18.46μg/ml：黃芪抑制HaCaT細胞增殖的IC50分別為341．O mg／ml，252．2 mg／ml，194．3mg／ml。在一定濃度范圍內其抑制率呈時間和劑量依賴性。③流式細胞儀檢測結果顯示，與陰性對照組相比，各濃度組依曲替酸G1期細胞百分比均明顯增加，S期和G2期細胞百分比減少，HaCaT細胞明顯阻滯于G1期。依曲替酸30μg/ml作用48小時有明顯的凋亡峰出現(xiàn)。電鏡

8、下出現(xiàn)典型的凋亡細胞形態(tài)學特征。黃芪作用48小時各期細胞比例介于依曲替酸15μg/ml和30μg/ml之間。④免疫組化：鏡下正常皮膚和銀屑病皮損標本均見陽性染色的角質形成細胞，即正常皮膚和銀屑病皮損都有VDR蛋白表達，銀屑病皮損的表達水平明顯強于正常皮膚標本(P<0.01)。陽性染色的細胞主要分布于基底細胞層，在銀屑病皮損這種分布趨勢尤其明顯。⑤Western印跡實驗：各組樣品均出現(xiàn)β-肌動蛋白和VDR與其單克隆抗體結合產生的免疫印跡條

9、帶，大小分別為42 kDa和58 kDa。半定量分析結果顯示依曲替酸作用后，HaCaT細胞VDR蛋白表達均較陰性對照組降低，而黃芪作用組VDR水平則與陰性對照組接近。⑥Real-Time RT-PCR方法：對樣品中的目的基因(VDRmRNA)進行相對表達量分析，結果顯示各用藥組HaCaT細胞VDRmRNA的相對表達量與陰性對照組相比無明顯差異，提示黃芪和各濃度依曲替酸均不能明顯改變VDR mRNA的表達。 結論：①芳香維A酸乙酯

10、膠囊、依曲替酸膠囊和中藥涼血活血復方治療銀屑病均有較好療效，其中維A酸類藥物的療效明顯優(yōu)于血活血復方，二代與三代維A酸間的療效無顯著性差異。黃芪與上述藥物聯(lián)合應用可提高療效。②依曲替酸和黃芪均對HaCaT細胞增殖有明顯的抑制作用，且在一定濃度范圍內其抑制率呈明顯的時間和劑量依賴性。二者亦可干擾HaCaT細胞周期，細胞阻滯于G1期，使之不能進入G2/M期進行分裂增殖；依曲替酸和黃芪作用于HaCaT細胞后均可誘導其凋亡，提示依曲替酸和黃芪的

11、抗銀屬病機制可能與此有關。③正常皮膚和銀屬病皮損表皮都有VDR蛋白表達，銀屑病皮損的VDR蛋白表達水平明顯高于正常皮膚標本；銀屑病皮損陽性染色的細胞明顯集中分布于基底細胞層。提示表皮細胞VDR蛋白異常表達可能是銀屑病的發(fā)病機制之一，同時也可能是1，25(OH)2D3衍生物治療銀屑病有效的分子基礎。④依曲替酸可使HaCaT細胞VDR蛋白表達減少，但不改變VDRmRNA水平，分析可能是依曲替酸促進了HaCaT細胞VDR蛋白降解，或者依曲替酸