PLCγ-PKC通路在洛克沙胂促血管生成中的作用.pdf

1、目的：洛克沙胂(3-硝基-4-羥基苯胂酸，Rox)，作為一種有機(jī)胂飼料添加劑，具有抗菌抗球蟲(chóng)、提高飼料報(bào)酬、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的作用，在世界范圍內(nèi)被廣泛使用。本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)洛克沙胂在體外具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，而洛克沙胂在促進(jìn)血管生成及其作用機(jī)制方面的研究報(bào)道極少，本文借助體外大鼠內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)、管形成模型和體內(nèi)小鼠黑色素移植瘤模型，通過(guò)MTT試驗(yàn)、BrdU細(xì)胞增殖試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)、管形成試驗(yàn)、免疫組化和WesternBlot方法，

2、研究PLCγ/PKC信號(hào)在洛克沙胂體內(nèi)外促血管生長(zhǎng)中作用。
　　方法：大鼠內(nèi)皮細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中，不同處理分組如下:PBS、0.1μM Rox、1.0μM Rox、10μM Rox、10ng/mL VEGF、40μM U73122、40μM U73122+1.0μM Rox。運(yùn)用MTT、BrdU、劃痕試驗(yàn)、管形成試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力、增殖、細(xì)胞遷移和血管樣結(jié)構(gòu)形成能力。應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測(cè)PLCγ/PKC信號(hào)蛋白的表達(dá)。在

3、小鼠B16黑色素移植瘤試驗(yàn)中，不同處理如下:PBS、1mg/kg Rox、5mg/kg Rox、25mg/kg Rox、10mg/kg SU5416、10mg/kg SU5416+5mg/kg Rox。各處理組在B16細(xì)胞注射后7d灌胃給予，持續(xù)7d。測(cè)量小鼠體重、瘤體積及重量;對(duì)腫瘤組織進(jìn)行HE染色及CD31免疫組化分析，Western Blot分析PLCγ/PKC信號(hào)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：MTT法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞處理24 h后的

4、細(xì)胞活力，結(jié)果顯示1.0Mm Rox組與PBS對(duì)照組相比OD值顯著升高(P＜0.05)，0.1μM Rox組和10μM Rox組無(wú)顯著性差異。1.0μMRox+U73122組與1.0μM Rox組相比OD值極顯著降低(P＜0.01)。
　　BrdU試驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞處理24h后細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示1.0μM Rox組與PBS對(duì)照組相比，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著(P＜0.05);0.1μM Rox組和10μM Rox組也增多，但差異不

5、顯著;1.0μM Rox+U73122組與1.0μM Rox組極顯著降低(P＜0.01)。
　　劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示1.0μM Rox組與PBS對(duì)照組相比，細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)（P＜0.05）;0.1μM Rox組和10μMRox組與PBS對(duì)照組比較遷移能力雖增強(qiáng)，但無(wú)顯著性差異;1.0μMRox+U73122組與1.0μM Rox組比較遷移能力極顯著降低(P＜0.01)。
　　管形成試驗(yàn)表明1.0μM Rox組與PBS對(duì)照組比

6、較，管數(shù)顯著增多(P＜0.05);0.1μM Rox組和10μM Rox組管數(shù)增多，但無(wú)顯著性差異。1.0μM Rox+U73122組與1.0μM Rox組比較，管數(shù)極顯著減少(P＜0.01）。
　　Western Blot分析表明，不同濃度Rox顯著促進(jìn)PLCγ、 PKC蛋白磷酸化（P＜0.05），1.0μMRox組與PBS對(duì)照組比較差異極顯著(P＜0.01);1.0μM Rox+U73122組與1.0μM Rox組比較，PLC

7、γ、 PKC蛋白磷酸化極顯著減少(P＜0.01)。
　　小鼠B16移植瘤模型試驗(yàn)表明不同濃度Rox處理后，小鼠腫瘤的重量和體積均增加，5、25mg/kg Rox組差異顯著(P＜0.05);10mg/kg SU5416+5mg/kg Rox組與5mg/kg Rox組比，腫瘤的重量和體積顯著減少(P＜0.01)。腫瘤組織HE染色及CD31免疫組化分析表明，不同濃度Rox處理后腫瘤組織中血管生長(zhǎng)相對(duì)良好;10mg/kg SU5416+5

8、mg/kg Rox組與5mg/kgRox組比較，腫瘤組織中出現(xiàn)壞死區(qū)域，血管生長(zhǎng)狀態(tài)不佳。Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明:不同濃度的Rox處理后，腫瘤組織中PLCγ、PKC蛋白磷酸化增加，差異顯著(P＜0.05);10mg/kgSU5416+5mg/kg Rox組與5mg/kg Rox組比較，PLCγ、PKC蛋白磷酸化減少，差異極顯著（P＜0.01)。
　　結(jié)論：洛克沙胂能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及血管形成，促進(jìn)小鼠B16移植