TRPV1及其致敏因子與子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)的關(guān)系及補(bǔ)腎溫陽化瘀方對(duì)其影響.pdf

1、目的:痛經(jīng)是子宮內(nèi)膜異位癥患者的主要癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，但其發(fā)生機(jī)制尚不明確，成為目前研究的熱點(diǎn)問題。本研究通過分析TRPV1及其致敏因子NGF、BK/BKB1R、PGF2α在內(nèi)異癥患者血清、在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜的變化，以期闡明內(nèi)異癥痛經(jīng)的部分發(fā)病機(jī)制;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是研究藥物治療本病作用機(jī)制的主要手段，但內(nèi)異癥痛經(jīng)的動(dòng)物模型卻未見報(bào)道，本研究嘗試?yán)媒幌礏ALB/c小鼠建立內(nèi)異癥痛經(jīng)模型;采用補(bǔ)腎溫陽化瘀方對(duì)內(nèi)異癥痛經(jīng)模型動(dòng)物進(jìn)行

2、干預(yù)，分析治療前后TRPV1及其致敏因子的變化，進(jìn)一步探討補(bǔ)腎溫陽化瘀方治療內(nèi)異癥痛經(jīng)的作用機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分:TRPV1及其致敏因子與子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)關(guān)系的研究
　　內(nèi)異癥組:選自2012年9月～2013年12月于石家莊市第四醫(yī)院住院并符合內(nèi)異癥納入標(biāo)準(zhǔn)的患者34例;對(duì)照組來自同期住院的子宮肌瘤無痛經(jīng)患者16例，所有患者術(shù)前抽取空腹肘靜脈血，術(shù)中取在位及異位內(nèi)膜組織，采用ELISA法檢測血清NGF、B

3、K、PGF2α的含量，采用免疫組化及Western blot方法檢測NGF、BKB1R、TRPV1蛋白的表達(dá)，采用Real-timePCR方法檢測NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA的表達(dá)。
　　第二部分:子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)動(dòng)物模型的建立
　　將68只清潔級(jí)近交系BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組、雌激素+縮宮素組、手術(shù)組、手術(shù)+雌激素組、手術(shù)+縮宮素組、手術(shù)+雌激素+縮宮素組，其中假手術(shù)組、

4、雌激素+縮宮素組每組10只，其余每組12只。除假手術(shù)組、雌激素+縮宮素組外其余各組均采用自體移植法將小鼠自體子宮組織塊移植到腹膜，復(fù)制子宮內(nèi)膜異位癥模型，術(shù)后1～12d采用不同方案誘發(fā)小鼠扭體反應(yīng)，記錄扭體潛伏期及扭體次數(shù)，并取異位灶行HE染色和病理組織學(xué)觀察，篩選建立內(nèi)異癥痛經(jīng)模型的最佳方案。
　　第三部分:補(bǔ)腎溫陽化瘀方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)模型小鼠TRPV1及其致敏因子的影響
　　75只近交系BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分為

5、5組:假手術(shù)組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組，每組15只。除假手術(shù)組外，其余各組均采用手術(shù)+雌激素+縮宮素建立小鼠內(nèi)異癥痛經(jīng)模型，并于術(shù)后1-12d同時(shí)給藥，于第12天誘發(fā)扭體反應(yīng)，斷頭取血并取子宮及異位灶組織。采用ELISA法、免疫組化法、Western blot方法及Real-time PCR方法檢測各組TRPV1及其致敏因子的變化。
　　結(jié)果:
　　第一部分:TRPV1及其致敏因子與子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)關(guān)系

6、的研究
　　1血清NGF、BK、PGF2α的含量及相關(guān)性分析結(jié)果
　　1.1血清NGF、BK、PGF2α的含量
　　內(nèi)異癥患者痛經(jīng)組血清NGF、BK、PGF2α水平較對(duì)照組及無痛組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。
　　1.2血清NGF、BK、PGF2α含量的相關(guān)性分析
　　NGF與PGF2α呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01），BK與PGF2α水平亦呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），NGF與B

7、K之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。
　　1.3血清NGF、BK、PGF2α含量與VAS評(píng)分的相關(guān)性分析
　　NGF與VAS評(píng)分呈正相關(guān)(P＜0.01)，PGF2α與VAS評(píng)分呈正相關(guān)（P＜0.01），BK含量與VAS評(píng)分呈正相關(guān)(P＜0.01)。
　　2免疫組化法檢測在位、異位內(nèi)膜組織中NGF、BKB1R、TRPV1蛋白的表達(dá)結(jié)果
　　2.1 NGF的表達(dá)
　　在位內(nèi)膜痛經(jīng)組NGF表達(dá)增強(qiáng)，與對(duì)照組及無

8、痛組相比顯著升高(P＜0.01，P＜0.05);異位內(nèi)膜痛經(jīng)組NGF的表達(dá)顯著高于無痛組(P＜0.05)。
　　2.2 BKB1R的表達(dá)
　　在位內(nèi)膜痛經(jīng)組BKB1R表達(dá)增強(qiáng)，與對(duì)照組及無痛組相比顯著升高（均為P＜0.01）;異位內(nèi)膜痛經(jīng)組BKB1R的表達(dá)顯著高于無痛組(P＜0.01)。
　　2.3 TRPV1的表達(dá)
　　在位內(nèi)膜痛經(jīng)組TRPV1的表達(dá)增強(qiáng)，與對(duì)照組及無痛組相比顯著升高(均為P＜0.01)。異位內(nèi)

9、膜痛經(jīng)組TRPV1的表達(dá)顯著高于無痛組(P＜0.01）。
　　3 Western blot法檢測在位、異位內(nèi)膜組織中NGF、BKB1R、TRPV1蛋白的表達(dá)結(jié)果
　　3.1在位、異位內(nèi)膜組織中NGF的表達(dá)
　　在位內(nèi)膜痛經(jīng)組NGF的表達(dá)高于對(duì)照組及無痛組（均為P＜0.01）;異位內(nèi)膜痛經(jīng)組NGF的表達(dá)顯著高于無痛組(P＜0.01）。
　　3.2在位、異位內(nèi)膜組織中BKB1R的表達(dá)
　　在位內(nèi)膜痛經(jīng)組BKB1

10、R的表達(dá)高于對(duì)照組及無痛組（均為P＜0.01）。異位內(nèi)膜痛經(jīng)組顯著高于無痛組(P＜0.01）。
　　3.3在位、異位內(nèi)膜組織中TRPV1的表達(dá)
　　在位內(nèi)膜痛經(jīng)組TRPV1的表達(dá)高于對(duì)照組及無痛組（均為P＜0.01）。異位內(nèi)膜痛經(jīng)組TRPV1的表達(dá)顯著高于無痛組(P＜0.01)。
　　3.4 NGF、BKB1R、TRPV1蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性分析
　　在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜NGF與BKB1R的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(均

11、為P＜0.01)，NGF與TRPV1的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05，P＜0.01)，BKB1R與TRPV1的表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系(均為P＜0.01)。
　　4 Real-time PCR檢測內(nèi)異癥在位、異位內(nèi)膜組織中NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA的表達(dá)結(jié)果
　　4.1在位、異位內(nèi)膜組織中NGFmRNA的表達(dá)
　　在位內(nèi)膜痛經(jīng)組NGFmRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組及無痛組(均為P＜0.01)。異位內(nèi)

12、膜NGF mRNA的表達(dá):痛經(jīng)組顯著高于無痛組（P＜0.01）。
　　4.2內(nèi)異癥在位、異位內(nèi)膜組織中BKB1RmRNA的表達(dá)
　　在位內(nèi)膜痛經(jīng)組BKB1RmRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組及無痛組（均為P＜0.01）;異位內(nèi)膜BKB1RmRNA的表達(dá)痛經(jīng)組高于無痛組(P＜0.01)。
　　4.3內(nèi)異癥在位、異位內(nèi)膜組織中TRPV1mRNA的表達(dá)
　　在位內(nèi)膜痛經(jīng)組TRPV1mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組及無痛組（均為P

13、＜0.01）;異位內(nèi)膜TRPV1mRNA的表達(dá):痛經(jīng)組顯著高于無痛組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01）。
　　4.4 NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA表達(dá)之間的相關(guān)性分析
　　在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜NGFmRNA與BKB1RmRNA的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(均為P＜0.01)，NGFmRNA與TRPV1mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(均為P＜0.01)，BKB1RmRNA與TRPV1mRNA的表達(dá)亦呈正相關(guān)關(guān)系(均為

14、P＜0.01)。
　　4.5 NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA表達(dá)與VAS評(píng)分的相關(guān)性分析
　　在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA的表達(dá)與VAS評(píng)分呈正相關(guān)關(guān)系(均為P＜0.01)。
　　第二部分:子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)動(dòng)物模型的建立
　　與手術(shù)+縮宮素組、手術(shù)組相比，手術(shù)+雌激素+縮宮素組、手術(shù)+雌激素組移植物體積明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)

15、;手術(shù)+雌激素+縮宮素組扭體發(fā)生率100％，雌激素+縮宮素組扭體發(fā)生率80％，手術(shù)+縮宮素組扭體發(fā)生率50％，其余組未出現(xiàn)扭體反應(yīng)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;與手術(shù)+縮宮素組、雌激素+縮宮素組相比，手術(shù)+雌激素+縮宮素組扭體潛伏期明顯縮短(P＜0.01，P＜0.05)，扭體次數(shù)明顯增多(P＜0.01，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第三部分補(bǔ)腎溫陽化瘀方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)模型小鼠TRPV1及其致敏因子的影響<

16、br>　　1補(bǔ)腎溫陽化瘀方對(duì)內(nèi)異癥痛經(jīng)模型小鼠扭體反應(yīng)的影響
　　與模型組相比，各給藥組扭體潛伏期明顯延長（均為P＜0.01），扭體次數(shù)顯著減少(P＜0.05或P＜0.01)。
　　2補(bǔ)腎溫陽化瘀方對(duì)內(nèi)異癥痛經(jīng)模型小鼠異位灶體積的影響
　　與模型組相比，各給藥后異位灶體積明顯縮小(均為P＜0.01)。
　　3補(bǔ)腎溫陽化瘀方對(duì)內(nèi)異癥痛經(jīng)模型小鼠血清NGF、BK、PGF2α的影響
　　模型組血清NGF、BK、P

17、GF2α含量顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05);與模型組相比，各給藥組NGF、BK、PGF2α含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)
　　4模型小鼠血清NGF、BK、PGF2α含量與扭體反應(yīng)的相關(guān)性分析
　　血清BK、PGF2α、NGF濃度與扭體次數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系（均為P＜0.01）;PGF2α濃度與扭體潛伏期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05); NGF、BK與扭體潛伏期之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)

18、關(guān)系(P＞0.05); NGF與BK呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），PGF2α與BK呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05），NGF與PGF2α亦呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。
　　5免疫組化法檢測NGF、BKB1R、TRPV1的表達(dá)結(jié)果
　　模型組子宮NGF、BKB1R、TRPV1表達(dá)顯著高于假手術(shù)組（均為P＜0.01）;與模型組相比，各給藥組子宮及異位灶NGF、BKB1R、TRPV1表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0

19、.01)。
　　6 Western blot檢測NGF、BKB1R、TRPV1蛋白的表達(dá)結(jié)果
　　與假手術(shù)組相比，模型組子宮NGF、BKB1R、TRPV1蛋白表達(dá)增高（均為P＜0.01）;與模型組相比，各給藥組子宮及異位灶NGF、BKB1R、TRPV1表達(dá)降低(均為P＜0.01)，且NGF、BKB1R、TRPV1蛋白的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系（均為P＜0.01）。
　　7 Real-time PCR檢測子宮及異位灶NGFmR

20、NA、BKB1RmRNA、TRPV1 mRNA的表達(dá)結(jié)果
　　與假手術(shù)組相比，模型組子宮NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1 mRNA表達(dá)增高（均為P＜0.01）;與模型組相比，各給藥組子宮及異位灶NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA表達(dá)不同程度下降(P＜0.01或P＜0.05)，且NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA的表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系（均為P＜0.01）。
　　結(jié)論:

21、　　1 NGF、BK、PGF2α在內(nèi)異癥患者血清中水平升高，且與痛經(jīng)程度呈正相關(guān)關(guān)系，TRPV1、NGF、BKB1R蛋白在內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜中表達(dá)增強(qiáng)，TRPV1mRNA、NGFmRNA、BKB1RmRNA在內(nèi)異癥痛經(jīng)患者在位內(nèi)膜及異位內(nèi)膜中表達(dá)增強(qiáng)，且與痛經(jīng)程度呈正相關(guān)。提示TRPV1及其致敏因子NGF、BK/BKB1R、PGF2α可能在內(nèi)異癥痛經(jīng)的發(fā)生過程中起重要作用;
　　2手術(shù)+雌激素+縮宮素組引起的扭體次數(shù)最多