TRPV1及其致敏因子與子宮內膜異位癥痛經的關系及補腎溫陽化瘀方對其影響.pdf

1、目的:痛經是子宮內膜異位癥患者的主要癥狀，嚴重影響患者的生活質量，但其發(fā)生機制尚不明確，成為目前研究的熱點問題。本研究通過分析TRPV1及其致敏因子NGF、BK/BKB1R、PGF2α在內異癥患者血清、在位內膜、異位內膜的變化，以期闡明內異癥痛經的部分發(fā)病機制;動物實驗是研究藥物治療本病作用機制的主要手段，但內異癥痛經的動物模型卻未見報道，本研究嘗試利用近交系BALB/c小鼠建立內異癥痛經模型;采用補腎溫陽化瘀方對內異癥痛經模型動物進行

2、干預，分析治療前后TRPV1及其致敏因子的變化，進一步探討補腎溫陽化瘀方治療內異癥痛經的作用機制。
　　方法:
　　第一部分:TRPV1及其致敏因子與子宮內膜異位癥痛經關系的研究
　　內異癥組:選自2012年9月～2013年12月于石家莊市第四醫(yī)院住院并符合內異癥納入標準的患者34例;對照組來自同期住院的子宮肌瘤無痛經患者16例，所有患者術前抽取空腹肘靜脈血，術中取在位及異位內膜組織，采用ELISA法檢測血清NGF、B

3、K、PGF2α的含量，采用免疫組化及Western blot方法檢測NGF、BKB1R、TRPV1蛋白的表達，采用Real-timePCR方法檢測NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA的表達。
　　第二部分:子宮內膜異位癥痛經動物模型的建立
　　將68只清潔級近交系BALB/c雌性小鼠隨機分為6組，分別為假手術組、雌激素+縮宮素組、手術組、手術+雌激素組、手術+縮宮素組、手術+雌激素+縮宮素組，其中假手術組、

4、雌激素+縮宮素組每組10只，其余每組12只。除假手術組、雌激素+縮宮素組外其余各組均采用自體移植法將小鼠自體子宮組織塊移植到腹膜，復制子宮內膜異位癥模型，術后1～12d采用不同方案誘發(fā)小鼠扭體反應，記錄扭體潛伏期及扭體次數(shù)，并取異位灶行HE染色和病理組織學觀察，篩選建立內異癥痛經模型的最佳方案。
　　第三部分:補腎溫陽化瘀方對子宮內膜異位癥痛經模型小鼠TRPV1及其致敏因子的影響
　　75只近交系BALB/c雌性小鼠隨機分為

5、5組:假手術組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組，每組15只。除假手術組外，其余各組均采用手術+雌激素+縮宮素建立小鼠內異癥痛經模型，并于術后1-12d同時給藥，于第12天誘發(fā)扭體反應，斷頭取血并取子宮及異位灶組織。采用ELISA法、免疫組化法、Western blot方法及Real-time PCR方法檢測各組TRPV1及其致敏因子的變化。
　　結果:
　　第一部分:TRPV1及其致敏因子與子宮內膜異位癥痛經關系

6、的研究
　　1血清NGF、BK、PGF2α的含量及相關性分析結果
　　1.1血清NGF、BK、PGF2α的含量
　　內異癥患者痛經組血清NGF、BK、PGF2α水平較對照組及無痛組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01或P＜0.05)。
　　1.2血清NGF、BK、PGF2α含量的相關性分析
　　NGF與PGF2α呈正相關關系(P＜0.01），BK與PGF2α水平亦呈正相關關系（P＜0.01），NGF與B

7、K之間未發(fā)現(xiàn)相關關系（P＞0.05）。
　　1.3血清NGF、BK、PGF2α含量與VAS評分的相關性分析
　　NGF與VAS評分呈正相關(P＜0.01)，PGF2α與VAS評分呈正相關（P＜0.01），BK含量與VAS評分呈正相關(P＜0.01)。
　　2免疫組化法檢測在位、異位內膜組織中NGF、BKB1R、TRPV1蛋白的表達結果
　　2.1 NGF的表達
　　在位內膜痛經組NGF表達增強，與對照組及無

8、痛組相比顯著升高(P＜0.01，P＜0.05);異位內膜痛經組NGF的表達顯著高于無痛組(P＜0.05)。
　　2.2 BKB1R的表達
　　在位內膜痛經組BKB1R表達增強，與對照組及無痛組相比顯著升高（均為P＜0.01）;異位內膜痛經組BKB1R的表達顯著高于無痛組(P＜0.01)。
　　2.3 TRPV1的表達
　　在位內膜痛經組TRPV1的表達增強，與對照組及無痛組相比顯著升高(均為P＜0.01)。異位內

9、膜痛經組TRPV1的表達顯著高于無痛組(P＜0.01）。
　　3 Western blot法檢測在位、異位內膜組織中NGF、BKB1R、TRPV1蛋白的表達結果
　　3.1在位、異位內膜組織中NGF的表達
　　在位內膜痛經組NGF的表達高于對照組及無痛組（均為P＜0.01）;異位內膜痛經組NGF的表達顯著高于無痛組(P＜0.01）。
　　3.2在位、異位內膜組織中BKB1R的表達
　　在位內膜痛經組BKB1

10、R的表達高于對照組及無痛組（均為P＜0.01）。異位內膜痛經組顯著高于無痛組(P＜0.01）。
　　3.3在位、異位內膜組織中TRPV1的表達
　　在位內膜痛經組TRPV1的表達高于對照組及無痛組（均為P＜0.01）。異位內膜痛經組TRPV1的表達顯著高于無痛組(P＜0.01)。
　　3.4 NGF、BKB1R、TRPV1蛋白表達之間的相關性分析
　　在位內膜、異位內膜NGF與BKB1R的蛋白表達呈正相關關系(均

11、為P＜0.01)，NGF與TRPV1的表達呈正相關關系(P＜0.05，P＜0.01)，BKB1R與TRPV1的表達亦呈正相關關系(均為P＜0.01)。
　　4 Real-time PCR檢測內異癥在位、異位內膜組織中NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA的表達結果
　　4.1在位、異位內膜組織中NGFmRNA的表達
　　在位內膜痛經組NGFmRNA的表達顯著高于對照組及無痛組(均為P＜0.01)。異位內

12、膜NGF mRNA的表達:痛經組顯著高于無痛組（P＜0.01）。
　　4.2內異癥在位、異位內膜組織中BKB1RmRNA的表達
　　在位內膜痛經組BKB1RmRNA的表達顯著高于對照組及無痛組（均為P＜0.01）;異位內膜BKB1RmRNA的表達痛經組高于無痛組(P＜0.01)。
　　4.3內異癥在位、異位內膜組織中TRPV1mRNA的表達
　　在位內膜痛經組TRPV1mRNA的表達顯著高于對照組及無痛組（均為P

13、＜0.01）;異位內膜TRPV1mRNA的表達:痛經組顯著高于無痛組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01）。
　　4.4 NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA表達之間的相關性分析
　　在位內膜、異位內膜NGFmRNA與BKB1RmRNA的表達呈正相關關系(均為P＜0.01)，NGFmRNA與TRPV1mRNA的表達呈正相關關系(均為P＜0.01)，BKB1RmRNA與TRPV1mRNA的表達亦呈正相關關系(均為

14、P＜0.01)。
　　4.5 NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA表達與VAS評分的相關性分析
　　在位內膜、異位內膜NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA的表達與VAS評分呈正相關關系(均為P＜0.01)。
　　第二部分:子宮內膜異位癥痛經動物模型的建立
　　與手術+縮宮素組、手術組相比，手術+雌激素+縮宮素組、手術+雌激素組移植物體積明顯增大，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)

15、;手術+雌激素+縮宮素組扭體發(fā)生率100％，雌激素+縮宮素組扭體發(fā)生率80％，手術+縮宮素組扭體發(fā)生率50％，其余組未出現(xiàn)扭體反應，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;與手術+縮宮素組、雌激素+縮宮素組相比，手術+雌激素+縮宮素組扭體潛伏期明顯縮短(P＜0.01，P＜0.05)，扭體次數(shù)明顯增多(P＜0.01，P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　第三部分補腎溫陽化瘀方對子宮內膜異位癥痛經模型小鼠TRPV1及其致敏因子的影響<

16、br>　　1補腎溫陽化瘀方對內異癥痛經模型小鼠扭體反應的影響
　　與模型組相比，各給藥組扭體潛伏期明顯延長（均為P＜0.01），扭體次數(shù)顯著減少(P＜0.05或P＜0.01)。
　　2補腎溫陽化瘀方對內異癥痛經模型小鼠異位灶體積的影響
　　與模型組相比，各給藥后異位灶體積明顯縮小(均為P＜0.01)。
　　3補腎溫陽化瘀方對內異癥痛經模型小鼠血清NGF、BK、PGF2α的影響
　　模型組血清NGF、BK、P

17、GF2α含量顯著高于假手術組(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05);與模型組相比，各給藥組NGF、BK、PGF2α含量顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)
　　4模型小鼠血清NGF、BK、PGF2α含量與扭體反應的相關性分析
　　血清BK、PGF2α、NGF濃度與扭體次數(shù)呈正相關關系（均為P＜0.01）;PGF2α濃度與扭體潛伏期呈負相關關系(P＜0.05); NGF、BK與扭體潛伏期之間未發(fā)現(xiàn)相關

18、關系(P＞0.05); NGF與BK呈正相關關系（P＜0.01），PGF2α與BK呈正相關關系(P＜0.05），NGF與PGF2α亦呈正相關關系(P＜0.01)。
　　5免疫組化法檢測NGF、BKB1R、TRPV1的表達結果
　　模型組子宮NGF、BKB1R、TRPV1表達顯著高于假手術組（均為P＜0.01）;與模型組相比，各給藥組子宮及異位灶NGF、BKB1R、TRPV1表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0

19、.01)。
　　6 Western blot檢測NGF、BKB1R、TRPV1蛋白的表達結果
　　與假手術組相比，模型組子宮NGF、BKB1R、TRPV1蛋白表達增高（均為P＜0.01）;與模型組相比，各給藥組子宮及異位灶NGF、BKB1R、TRPV1表達降低(均為P＜0.01)，且NGF、BKB1R、TRPV1蛋白的表達存在正相關關系（均為P＜0.01）。
　　7 Real-time PCR檢測子宮及異位灶NGFmR

20、NA、BKB1RmRNA、TRPV1 mRNA的表達結果
　　與假手術組相比，模型組子宮NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1 mRNA表達增高（均為P＜0.01）;與模型組相比，各給藥組子宮及異位灶NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA表達不同程度下降(P＜0.01或P＜0.05)，且NGFmRNA、BKB1RmRNA、TRPV1mRNA的表達存在正相關關系（均為P＜0.01）。
　　結論:

21、　　1 NGF、BK、PGF2α在內異癥患者血清中水平升高，且與痛經程度呈正相關關系，TRPV1、NGF、BKB1R蛋白在內異癥患者在位內膜、異位內膜中表達增強，TRPV1mRNA、NGFmRNA、BKB1RmRNA在內異癥痛經患者在位內膜及異位內膜中表達增強，且與痛經程度呈正相關。提示TRPV1及其致敏因子NGF、BK/BKB1R、PGF2α可能在內異癥痛經的發(fā)生過程中起重要作用;
　　2手術+雌激素+縮宮素組引起的扭體次數(shù)最多