煙草西柏三烯一醇合成酶基因(CYC)的表達規(guī)律和調(diào)控研究.pdf

1、CYC基因編碼西柏三烯一醇合成酶，是煙草腺毛分泌物合成的關(guān)鍵基因。為明確CYC基因的表達規(guī)律，本文利用RT-PCR技術(shù)，對煙草不同類型（達白1號、雪茄1號、Basma、K326）、不同烤煙品種（K326、中煙100、紅花大金元、翠碧1號、豫煙11號）和煙草K326不同組織（根、莖、上部葉、中部葉、下部葉、腺毛、去腺毛葉片、花）中的CYC基因的表達進行了系統(tǒng)分析。在此基礎(chǔ)上，克隆了CYC基因啟動子序列，構(gòu)建了CYC-Pro-GUS inf

2、usion表達載體并轉(zhuǎn)化煙草，通過對轉(zhuǎn)基因植株進行GUS組織化學(xué)染色和GUS酶活檢測，分析了CYC啟動子的組織表達特性及其對溫度應(yīng)答反應(yīng)模式。另外，對CYC-RNAi轉(zhuǎn)基因植株進行了農(nóng)藝性狀和葉面化學(xué)成分分析，為該基因在煙草抗性及品質(zhì)改良中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下。
　　1.利用RT-PCR技術(shù)，分析了煙草不同類型、不同烤煙品種、不同組織器官中CYC基因的表達特性：在不同煙草類型中，香料煙Basma中CYC基因相對表達量最

3、高，其次是烤煙K326，雪茄1號和達白1號中較低；在烤煙不同品種中，K326中CYC基因的相對表達量顯著最高，其次為“紅大”和“豫煙11號”，“翠碧1號”較低，“中煙100”最低；在煙草K326不同組織中，腺毛中CYC基因表達量顯著高于花、去腺毛葉片、上部葉、中部葉、下部葉、根和莖。說明煙草CYC基因的表達具有類型、品種及組織特異性。
　　2.煙草CYC基因啟動子活性分析：從煙草品種8306DNA中分離出CYC基因啟動子，并將啟動

4、子插入pC-NPT-GUS載體中，構(gòu)建了表達載體pC-CYC-Pro-GUS，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和葉盤法轉(zhuǎn)化煙草K326，在Kan濃度30mg/ml條件下篩選得到陽性植株，取轉(zhuǎn)基因煙草和對照K326的根、莖和葉片，分別進行GUS染液染色，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的葉片和莖上的腺毛均染上藍色，而K326沒有。證明CYC基因啟動子成功整合至煙草K326的基因組中，并使外源基因GUS在煙草腺毛中特異表達，說明CYC基因啟動子在腺毛中特異表達。進一步對轉(zhuǎn)基

5、因植株分別進行4℃和42℃的溫度處理，對照為28℃條件下的轉(zhuǎn)基因植株，在1小時、6小時、12小時時分別取樣，提取GUS酶蛋白，進行GUS酶活檢測后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4℃和42℃處理的轉(zhuǎn)基因煙草的GUS酶活性均小于28℃條件下的活性，表明煙草CYC基因啟動子的表達受溫度調(diào)控。
　　3.CYC基因抑制表達對煙草葉面化學(xué)的影響：將10個CYC-RNAi轉(zhuǎn)基因株系在可控條件下進行田間試驗，按照優(yōu)質(zhì)煙草栽培技術(shù)規(guī)范進行栽培管理。在煙葉成熟期時采用圓