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文檔簡介
1、類風濕性關節(jié)炎(RA)是以關節(jié)病變?yōu)橹鞑橛卸嘞到y(tǒng)受累的慢性炎癥性疾病,發(fā)病率仍呈上升趨勢,市場上對治療類風濕性關節(jié)炎的有效藥物需求極大。目前西醫(yī)抗RA常用一、二線藥物和糖皮質(zhì)激素,但這些藥物大多毒副作用和不良反應較大,依賴性強。為此尋找一種安全、有效、可控,用于治療類風濕性關節(jié)炎和改善癥狀的中藥新制劑具有積極意義。 采用蟾酥制成軟膏劑,選用透皮給藥方法可避免肝臟首過效應和胃腸道破壞,不受胃腸道酶、消化液、pH值等諸多因素的影響
2、,可提高生物利用度,達到既可延長藥物作用時間,又可降低藥物毒性和副作用,維持穩(wěn)定而持久的血藥濃度的目的,為RA患者提供一個更有效的治療方法。 本課題研究目的是探索蟾酥軟膏對類風濕性關節(jié)炎抗炎鎮(zhèn)痛的藥效作用,并考察對關節(jié)的病理影響,為治療RA提供一個更有效的方法,并擴大蟾酥的用藥途徑。 方法: 本課題實驗研究分為三個部分: 1.蟾酥軟膏的鎮(zhèn)痛作用研究 1.1 熱板法 取SPF級18~22g痛
3、閾5~30sNIH小鼠,雌性,隨機分5組,即空白對照組、陽性對照組(法斯通凝膠)、3%、6%、12%蟾酥軟膏組,各組小鼠腹部剃毛,空白組外涂卡波姆基質(zhì)0.1g/只,陽性對照組外涂法斯通0.1g/只,其余給藥組外涂各濃度蟾酥軟膏0.1g/只,每天涂藥1次,連續(xù)7天,末次涂藥后30,60,90min各把小鼠放在預熱至50℃的智能熱板儀上,以小鼠舔后足反應的潛伏期為痛閾指標,比較各組差異。 1.2 扭體法 取SPF級18~22
4、gNIH小鼠,雌雄各半,隨機分為空白對照組、陽性對照組、3%蟾酥軟膏組、6%蟾酥軟膏組和12%蟾酥軟膏組,腹部剃毛后分別外涂該組藥物0.1g/只/天,連續(xù)7天,末次涂藥后1h腹腔注射0.6%醋酸生理鹽水0.01ml/g體重,觀察并記錄30min內(nèi)小鼠出現(xiàn)的扭體次數(shù),比較各組差異。 2.蟾酥軟膏的抗炎作用研究 2.1 蟾酥軟膏對蛋清所致大鼠足腫脹的影響 SPF級體重180~220g SD大鼠,雌雄各半,隨機分為空白
5、對照組、陽性對照組、3%、6%和12%蟾酥軟膏組。先用足趾容積測量儀測量大鼠后肢足趾容積,然后分別足趾部外涂該組藥物1g/只/天,連續(xù)7天,末次涂藥后1h每鼠右后足跖皮下注射新鮮蛋清0.2ml,分別于1、2、3、4h測量大鼠后肢足趾容積各一次,計算足趾腫脹程度,比較各組差異。 2.2 蟾酥軟膏對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響 SPF級體重18~22g NIH小鼠,雌雄各半,隨機分為空白對照組、陽性對照組、3%、6%和12%
6、蟾酥軟膏組,腹部剃毛分別外涂該組藥物0.1g/只/天,連續(xù)7天,末次涂藥后1h每只小鼠均尾靜脈注射0.5%伊文思藍0.01ml/g體重,隨即腹腔注射0.6%醋酸生理鹽水0.2ml/只,20min后脫頸椎處死,剖開腹腔,用5ml生理鹽水洗滌數(shù)次,收集洗液并調(diào)整終體積至8ml,離心,取上清液于分光光度計590nm測吸光度,比較各組差異。 2.3 蟾酥軟膏對大鼠棉球肉芽腫的影響 SPF級體重180~220g SD大鼠,雌雄各半
7、,隨機分為空白對照組、陽性對照組、3%、6%和12%蟾酥軟膏組。大鼠乙醚淺麻醉,腹部用碘酒消毒,75%酒精棉球脫碘,切1cm長小口,取兩個20±1mg高壓滅菌棉球分別植入大鼠兩側(cè)腋窩皮下,隨即縫合皮膚。手術當日始分別外涂該組藥物0.1g/只/天,連續(xù)7天,末次給藥后脫頸椎處死,取出棉球,剔除脂肪組織,放烘箱60℃烘干,稱重,減去原棉球重量即得肉芽腫凈重。 2.4 蟾酥軟膏對佐劑性關節(jié)炎大鼠模型的影響 SPF級體重180~
8、220g SD大鼠,雌雄各半,隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組、3%、6%和12%蟾酥軟膏組。模型組、陽性對照組、3%、6%和12%蟾酥軟膏組每鼠右后足跖皮下注射弗氏完全佐劑0.1ml,空白對照組大鼠右后足跖皮下注射生理鹽水0.1ml,然后分別外涂該組藥物1g/只/天,連續(xù)7天。觀察指標: a.足趾腫脹程度的測量:造模前先用足趾容積測量儀測量大鼠后肢足趾容積,此后隔周測量大鼠右后肢足趾容積各一次,計算足趾腫脹程度,比較各組
9、差異。 b.足跖組織液IL-1β、TNF-α、PGE<,2>的含量測定:末次涂藥后1h,剝離足跖關節(jié)皮毛、肌肉,取足跖關節(jié)剝除趾骨后將組織勻漿,測定大鼠足跖組織液IL-1β、INF-α、PGE<,2>的含量。 c.血清SOD活力的檢測:末次涂藥后1h,每只動物從心臟抽血1ml離心取血清按SOD測試盒方法檢測大鼠血清SOD活力。 d.血沉的測定:末次涂藥后1h,每只動物從心臟抽血1.6ml加入0.4ml枸櫞酸鈉抗凝
10、劑,吸入血沉管至“0”刻度處,將血沉管直立在血沉架上記時,在室溫22℃下靜置1h,觀察記錄紅細胞下沉mm數(shù)。 e.足跖關節(jié)病理觀察:末次涂藥后1h將大鼠放清體血,剝離足趾關節(jié)皮毛、肌肉、肌腱組織并暴露關節(jié),取足趾關節(jié)剝除滑膜后以中性福爾馬林固定。EDTA液脫鈣2周后石蠟包埋,切片HE染色檢測,觀察軟骨缺損范圍深度、纖維組織增生、軟骨炎細胞浸潤等。 3.皮膚毒理學實驗研究 3.1 皮膚急性毒性試驗研究 普通
11、級新西蘭兔,雌雄各半,體重2.0kg左右,隨機分成對照組(卡波姆基質(zhì))和試驗組(21.6%蟾酥軟膏,為最大可溶濃度):完整皮膚組和破損皮膚組。取每種受試藥物3g分別均勻涂于脫毛區(qū),并用無刺激性紗布及繃帶加以固定。給予受試藥物24小時,去除受試物后1,24,48,72小時至第七日,每日觀察并記錄動物的體重、皮膚毛發(fā)、眼和粘膜的變化、呼吸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動等及其他中毒表現(xiàn)。 3.2 皮膚刺激性試驗研究 動物:普通級新西
12、蘭兔,雌雄各半,體重2.0kg左右。 a.完整皮膚的局部刺激性試驗:試驗采用同體左右側(cè)自身對比,左側(cè)去毛區(qū)涂受試藥21.6%蟾酥軟膏1g,右側(cè)去毛區(qū)涂卡波姆基質(zhì)1g,并用無刺激性紗布及繃帶加以固定。其中單次給藥刺激性試驗在涂藥24h后,用溫水洗去殘留藥物,去除受試藥物后1h,24 h,48h,72h.肉眼觀察皮膚反應;多次給藥刺激性試驗連續(xù)給藥7天,再停藥7天。除觀察、記錄每日的紅斑及水腫情況還應觀察涂藥部位是否有色素沉著、出血
13、點、皮膚粗糙或者皮膚菲薄等情況。 b.破損皮膚的局部刺激性試驗:試驗前24h,用脫毛劑將兔背部脊柱兩側(cè)脫毛后再用細砂紙摩擦造成局部擦傷,以局部滲血為度,左右兩側(cè)皮膚的破損程度應基本一致。其余步驟同完整皮膚局部刺激性試驗。 3.3 皮膚致敏試驗研究 普通級白化豚鼠,雌雄各半,體重200g~250g,隨機均分為空白對照組(卡波姆基質(zhì))、陽性對照組(1%2,4-二硝基氯代苯)和試驗組(21.6%蟾酥軟膏)共3組,雌雄各
14、半。致敏接觸:于左側(cè)褪毛區(qū),空白對照組涂卡波姆基質(zhì)0.2g,陽性對照組涂1%的DNCB 0.2ml,試驗組涂21.6%蟾酥軟膏0.2g。所有動物涂藥后,用無菌紗布覆蓋,無刺激膠布封閉、固定,動物分籠飼養(yǎng),維持6h,于涂藥后第7天和第14天,以同樣的方法重復涂藥一次。激發(fā)接觸:于末次給藥后第14天,先用溫水洗凈右側(cè)褪毛區(qū),空白對照組涂卡波姆基質(zhì)0.2g,陽性對照組涂0.1%的DNCB 0.2ml,試驗組涂21.6%蟾酥軟膏0.2g。分別于
15、給藥6h、24b、48h、72h觀察皮膚過敏反應情況,記錄各時間點所有動物的過敏反應分值,同時注意觀察動物是否有哮喘、站立不穩(wěn)或休克等嚴重的全身性過敏反應。 結論: 通過熱板法和扭體法實驗,說明了三個濃度蟾酥軟膏均一定的鎮(zhèn)痛作用,尤以6%蟾酥軟膏作用最明顯。 采用蛋清致大鼠足趾腫脹,蟾酥軟膏各濃度組均能減輕足趾腫脹程度,對一般性炎癥有一定抗炎作用。小鼠腹腔注射醋酸能使毛細血管通透性增加,蟾酥軟膏可抑制這種作用,緩
16、解毛細血管液體滲出。蟾酥軟膏對大鼠棉球植入引起的肉芽腫增生有明顯的抑制作用。 采用弗氏完全佐劑大鼠足趾部注射造成大鼠佐劑性關節(jié)炎,蟾酥軟膏各濃度組均能減輕足趾腫脹程度,有一定抗炎作用。蟾酥軟膏可以有效減少佐劑性關節(jié)炎關節(jié)組織液IL-1β、TNF-α和PGE<,2>的含量,從而抑制它們的致炎作用,減緩炎癥滲出及軟骨破壞。蟾酥軟膏能增強SOD活力,使自由基歧化而清除,減緩炎癥損傷。90%類風濕性關節(jié)炎病人血沉加快,可能由于炎癥分子引
17、起的纖維蛋白原的激活而使血紅細胞沉降速度加快,蟾酥軟膏能減緩血沉速度的加快。足跖關節(jié)病理切片光鏡下觀察,與模型組比較,陽性對照組和6%、12%蟾酥軟膏組大鼠足跖軟骨關節(jié)破壞較輕,炎性浸潤和纖維組織增生不及模型組嚴重,說明蟾酥軟膏能防止大鼠佐劑性關節(jié)炎關節(jié)受炎癥破壞受損。 蟾酥軟膏最大可溶濃度(21.6%),試驗過程中未出現(xiàn)受試動物中毒表現(xiàn),并無引起受試動物出現(xiàn)皮膚刺激性及過敏現(xiàn)象,說明蟾酥軟膏在局部皮膚用藥上是基本安全的。
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