高嘌呤飲食及羅格列酮干預(yù)對(duì)OLETF大鼠血尿酸水平的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：觀察不同濃度脂蛋白對(duì)腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)人尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子(human urate transporter hUAT)mRNA和人尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(human organic anion transporter 1，hOAT1)mRNA表達(dá)的影響表達(dá)的影響。 方法：所有實(shí)驗(yàn)均在體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞上進(jìn)行。根據(jù)培養(yǎng)液中所含脂蛋白，將HK-2細(xì)胞分為3大組。①單純采用DMEM培養(yǎng)基組(對(duì)照組)；②極低密度脂蛋白(VLDL

2、)組：V1組：DMEM/F-12+50ug/mlVLDLV2組：DMEM/F-12+400ug/mlVLDL。③高密度脂蛋白(HDL)組：H1組：DMEM/F-12+50ug/mlHDLH2組：DMEM/F-12+400ug/mlHDL。每種條件下，均培養(yǎng)6瓶細(xì)胞取均數(shù)，培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)，抽提總RNA。取1ugRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR共擴(kuò)增hUAT、hOAT1和內(nèi)參照GAPDH目的片段，分析計(jì)算hUAT和hoA

3、T1mRNA相對(duì)表達(dá)量。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程重復(fù)一次。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。 結(jié)果：①所有標(biāo)本均能檢測(cè)到hUAT和hOAT1mRNA的表達(dá)。②隨著VLDL濃度的增加，hUATmRNA表達(dá)水平明顯下降；對(duì)照組hUATmRNA表達(dá)水平明顯高于V1、V2組，差異有顯著性(P=0.000)，hUATmRNA表達(dá)水平V1組和V2組間差異有顯著性(P＜0.001)。③隨著VLDL濃度的增加，hOAT1mRN

4、A表達(dá)水平明顯下降；對(duì)照組hOAT1mRNA表達(dá)水平明顯高于V1、V2組，差異有顯著性(P=0.000)。V1和V2組間差異無顯著性(P=0.927)④隨HDL濃度的增加，hUATmRNA表達(dá)水平下降；對(duì)照組hUAT1mRNA表達(dá)水平明顯高于H1、H2組，差異有顯著性(P=0.000)，H1組和H2組間差異有顯著性(P＜0.05)。⑤隨HDL濃度的增加，hOAT1mRNA表達(dá)水平增加；對(duì)照組hOAT1mRNA表達(dá)水平明顯低于H1、H2組

5、，差異有顯著性(P=0.000)，H1組和H2組間差異無顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論：VLDL，HDL水平升高所導(dǎo)致的hUATmRNA表達(dá)水平下調(diào)，可能是脂代謝紊亂引起高尿酸血癥的重要機(jī)制。HDL對(duì)hOAT1mRNA表達(dá)水平上調(diào)作用，提示HDL可能具有一定的增加尿酸排泄作用。 目的：研究高嘌呤飲食及羅格列酮干預(yù)對(duì)OLETF大鼠血尿酸水平及腎小管上皮細(xì)胞有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(organicaniontransporter1

6、，OAT1)、尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子(uratetransporter，UAT)基因表達(dá)的影響。 方法：30只4周齡雄性O(shè)LETF大鼠普通飲食喂養(yǎng)至第25周齡時(shí)，隨機(jī)分為對(duì)照組和高嘌呤飲食組，其中對(duì)照組10只、高嘌呤飲食組20只。高嘌呤飲食組給予10％高酵母飼料喂養(yǎng)，同時(shí)給予腺嘌呤溶液灌胃(50mg/kg/d)，對(duì)照組給予普通飲食，同時(shí)每日給予同體積蒸餾水灌胃。同系4周齡雄性LETO大鼠30只，作為OLETF大鼠的實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，其分組及處理

7、方法同上。監(jiān)測(cè)大鼠血尿酸(SUA)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、24小時(shí)尿量及尿尿酸(UUA)，放免法測(cè)定血胰島素水平，比較兩種大鼠高尿酸血癥的發(fā)病情況。待OLETF大鼠高嘌呤飲食組與對(duì)照組兩組間血尿酸水平出現(xiàn)顯著差異時(shí)，進(jìn)一步將高嘌呤飲食組隨機(jī)分為兩組，其中一組繼續(xù)給予高嘌呤飲食(即高嘌呤飲食組)，另一組在高嘌呤飲食基礎(chǔ)上進(jìn)行羅格列酮干預(yù)(即羅格列酮干預(yù)組)，血尿酸在各組問有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)，

8、處死所有大鼠。取大鼠腎皮質(zhì)抽提總RNA，應(yīng)用TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)共擴(kuò)增OAT1、UAT和內(nèi)參照GAPDH目的片段，分析計(jì)算OAT1、UATmRNA相對(duì)表達(dá)量。取大鼠腎組織制備石蠟切片，進(jìn)行熒光免疫組織化學(xué)染色，SimplePCI圖像分析軟件分析OAT1、UAT的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：①高嘌呤飲食后第11天，OLETF和LETO高嘌呤飲食組的血尿酸水平均較對(duì)照組顯著升高(P=0.000)

9、，OLETF高嘌呤飲食組較LETO高嘌呤飲食組亦顯著升高(P=0.008)；②OLETF大鼠高嘌呤飲食組中，高尿酸血癥的患病率為84.21％，LETO大鼠患病率為36.84％，兩組發(fā)病率具有顯著差異(P＜0.05)；③高嘌呤飲食后，OLETF大鼠高嘌呤飲食組OAT1mRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(t'=21.690，P=0.000)，LETO大鼠高嘌呤飲食組與對(duì)照組相比無顯著性差異(t'=-1.541，P=0.162)。OLETF大

10、鼠高嘌呤飲食組OAT1，mRNA的表達(dá)水平與LETO大鼠高嘌呤飲食組相比亦顯著降低(P=0.000)；④高嘌呤飲食后，LETO大鼠高嘌呤飲食組UATmRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(t'=8.241，P=0.000)，OLETF大鼠高嘌呤飲食組UATmRNA的表達(dá)水平較對(duì)照組亦明顯降低(t'=23.090，P=0.000)，且其降低程度較LETO鼠更甚(P＜0.05)。⑤羅格列酮干預(yù)后第21天，高嘌呤飲食組血尿酸水平顯著高于對(duì)照組(P

11、=0.002)，而羅格列酮干預(yù)組顯著低于高嘌呤飲食組(P=0.047)，與對(duì)照組相比無顯著差異(P=0.183)；⑥實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示：OLETF大鼠高嘌呤飲食組及羅格列酮干預(yù)組OAT1、UATmRNA的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，羅格列酮干預(yù)組OAT1、UATmPNA的表達(dá)水平較高嘌呤飲食組顯著升高(P＜0.05)，但仍明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。⑦熒光免疫組化結(jié)果顯示：對(duì)照組、高嘌呤飲食組及羅格列酮干預(yù)組腎臟近端

12、小管上皮細(xì)胞均有OAT1、UAT的表達(dá)。SimplePCI軟件分析結(jié)果示：高嘌呤飲食組OAT1、UAT的吸光度值較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，羅格列酮干預(yù)組OAT1、UAT的吸光度值較高嘌呤飲食組明顯升高(P＜0.05)。 結(jié)論：高嘌呤飲食可導(dǎo)致代謝綜合征大鼠(OLETF大鼠)血尿酸水平的顯著升高，且其高尿酸血癥的發(fā)病率顯著高于同系正常大鼠(LETO大鼠)，其機(jī)制可能與高嘌呤飲食后OLETF大鼠OAT1、UAT的表達(dá)較LET